| 저자(한글) |
YU, Shu-zhen,FENG, Chong,SHI, Ning-ning,SONG, Xiao-feng,PAN, Deng-ke |
| 초록 |
목적: 돼지 인슐린 프로모터를 조절하는 외인성 유전자의 고효율적 발현 벡터를 획득한다. 이로써 목표 유전자를 특이적으로 발현하는 형질전환 돼지 모델 구축에 기초를 마련한다. 기법: 돼지 인슐린 프로모터(PIP, 5' 조절부위, 제1 엑손, 제1 인트론, 제2 엑손 ATG 앞의 서열을 포함하여 모두 1.5kb)를 이용하여 발현 벡터를 구축한다. PIP와 EGFP를 연결하는 HindⅢ 효소 절단 부위를 시작 코돈 앞에 설계하고 PIP-HindⅢ-EGFP로 명명한다. 효소 절단 부위의 삽입 위치가 외인성 유전자의 발현 효율에 미칠 수 있는 영향을 고려하여 벡터를 최적화하였다. HindⅢ 효소 절단 부위를 제거함으로써 PIP와 EGFP를 끊김없이 연결하고 PIP-EGFP 벡터로 명명한다. 제1 인트론 3' 말단의 인트론 이어맞추기 수용부위(splicing acceptor site, SA)를 HindⅢ 절단효소 식별 부위로 돌연변이시키고 PIP-SA(M)-EGFP로 명명한다. 세가지 벡터를 사용하여 쥐 인슐린종(insulinoma) β 세포주 MIN-6 세포, 돼지귀 섬유아세포, 돼지 신장세포를 각각 형질전환한다. 형질전환하여 48시간 후 형광 강도, 유세포 분석, RT-PCR, Western blot 방법을 사용하여 각 벡터의 발현 효율을 검사했다. 결과: 세포 형질전환 후, 세가지 벡터 모두 MIN-6 인슐린 β 세포에서만 녹색 형광을 나타냈다. RT-PCR 및 생성물 서열 분석 결과, 인슐린 프로모터 제1 인트론 절단에 있어 세가지 벡터는 차이를 보였다. PIP-HindⅢ-EGFP 및 PIP-EGFP 벡터의 인트론은 절단되는 상황과 절단되지 않는 상황이 발생하였고 안정적이지 않았다. PIP-SA(M)-EGFP 벡터의 SA 부위는 돌연변이 후 인트론은 절단되지 않았다. 유세포 분석 및 Western blot 검사 결과, 나머지 두가지 벡터에 비해 PIP-SA(M)-EGFP 벡터의 목표 단백질 발현량은 가장 높았다. 결론: 인슐린 프로모터 제1 인트론 3' 말단의 이어맞추기 수용부위에 대한 돌연변이를 통해 인슐린 β 세포의 고효율적 발현 벡터를 성공적으로 획득하였고, 외인성 유전자로 인슐린을 특이적으로 발현하는 형질전환 돼지 모델 구축에 이용할 수 있었다. |
