| 초록 |
Bst DNA 중합효소(Bst DNA polymerase)는 열안정성(themostable), 사슬 치환 활성(strand displacement amplification activity) 및 중합효소 활성(polymerase activity)이 있으므로 생체외 DNA 등온증폭(DNA in vitro isothermal amplification) 반응에서 중요한 작용을 한다. 본 논문에서는 Bst DNA 중합효소의 5 rsquo; rarr;3 rsquo; 중합효소, 뉴클레오티드(nucleotide)(말단) 전이효소 및 사슬 치환 활성에 근거하여 한 가지 새로운 생체외 고리모양 DNA를 증폭하는 기술인SRCA(saltatory rolling circle amplification) 기술을 개발하였다. SRCA 반응과정에서 Bst DNA 중합효소의 상류 프라이머 P1를 템플릿으로 하여 상보적인 사슬 RcP1을 합성하였으며, 또한 P1와 결합시켜 2중 가닥 DNA(double stranded DNA)를 합성한 후, Bst DNA 중합효소 중의 뉴클레오티드 전이 효소 활성을 이용하여 P1의 3 rsquo;말단 위치로 부터 5 rsquo; rarr;3 rsquo; 방향으로 임의의 디옥시리보뉴클레오티드가 중합되어 형성된 올리고뉴클레오티드(dNMP)m서열을 삽입하였는데 해당 삽입과정의 DNA 합성반응은 RcP1와 하류 프라이머 P2사이의 결실위치를 경과하였다. 그리고 하류 프라이머 P2를 템플릿으로 하여 상보적 서열(RcP2)을 합성한 후, Bst DNA 중합효소를 이용하여 디옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)를 임의로 RcP2의 3 rsquo;말단에 주입시켜 (dNMP)n서열을 합성하였다. 또한 Bst DNA 중합효소에 대하여 RcP1를 템플릿으로 하여 계속하여 촉매화 중합반을 진행하여 상보적인 새로운 사슬을 합성하였으며, 또한 합성한 새로운 사슬 중의 사슬 치환 효소 활성을 이용하여 P1를 치환하였다. 이러한 과정을 계속하여 반복하여 [P1-(dNMP)m-RcP2-(dNMP)n- hellip;] 서열을 합성하였다. 본 논문에서는 또한 전기영동(electrophoresis), 효소절단(enzymatic digestion), 서열측정 등 방법을 이용하여 증폭산물에 대하여 분석을 진행하였으며, 또한 이러한 증폭 과정을 예측하였다. 그리고 이러한 과정이 진행되는 원리를 토의하였다. 해당 반응은 동온증폭 기술로 미생물을 검출하는 방법을 개발하는데 도움이 될 것이이며, 또한 LAMP(loop-mediated isothermal amplification) 기술 중 가짜양성반응(false positive reaction) 및 RCA(rolling circle amplification) 반응 중 배경신호(background signal)의 해석에 참고적 근거를 제공할 것이다. |
