| 초록 |
난센스-매개 전사체 붕괴(nonsense-mediated mRNA decay, NMD) 경로는 진핵생물 체내의 일종 중요한 mRNA 감시 및 품질 제어 메커니즘이다. 그는 난센스 돌연변이, 잘못된 이어맞추기(Splicing), 틀이동 돌연변이(frameshift mutation) 등으로 인한 조발성 번역 종결 코돈(premature translation termination codon, PTC)을 함유한 mRNA를 분해한다. 따라서 이런 mRNA 번역에 의해 생성된 절단형 단백질이 생체에 미치는 손상을 예방할 수 있다. 연구 결과, 일부 PTC를 함유한 mRNA는 NMD 경로 탈출(NMD-escape)을 발생한다. 그러나 그의 구체적인 메커니즘은 아직 명확하게 밝혀지지 않았다. 본 연구는 망막모세포종 유전자 1(retinoblastoma gene 1, RB1)을 NMD 경로의 표적 유전자로 사용하여 엑손 1~14(cDNA), 인트론(Intron) 14-엑손 15-인트론 15와 엑손 16~27(cDNA) 등 3개 부분 서열을 포함한 mini-RB1 유전자를 구축하고, 그를 진핵 발현 벡터 pcDNA 3.1(-)에 형질전환하였다. 인류 게놈의 돌연변이 데이터베이스에 근거하여 3개 돌연변이 위치 W99X, G310X와 R467X를 선택하고 대응되는 난센스 돌연변이체를 구축하였다. mini-RB1 유전자의 야생형과 넌센스 돌연변이체를 각각 HeLa 세포에 형질전환하였다. qRT-PCR 기법으로 검사한 결과, W99X 난센스 돌연변이체의 mRNA 수준이 야생형과 큰 차이가 없었다. mini-RB1(W99X)의 NMD 탈출을 한층 더 입증하기 위해, NMD 경로 억제제인 방선균 시클로헥시마이드(cycloheximide)와 전사 억제제인 악티노마이신(actinomycin) D를 이용하여 야생형 mini-RB1과 그의 난센스 돌연변이체 mini-RB1(W99X)를 형질전환한 포유동물 세포를 각각 처리하였다. 그 결과 mini-RB1 난센스 돌연변이체의 mRNA 발현 수준이 야생형과 큰 차이가 없었다. 이는 W99X 난센스 돌연변이를 함유한 mini-RB1의 mRNA이 NMD 탈출을 발생했다는 것을 설명한다. Western 블롯팅 기법을 통하여 mini-RB1 유전자의 단백질 발현을 검사한 결과, 난센스 돌연변이 위치의 W99X 하위에서 단백질의 번역 재시작(translation re-initiation)이 발생한 것으로 확인되었다. 그러므로 PTC 하위 단백질의 번역 재시작이 난센스 mRNA의 NMD 경로 탈출을 초래하는 주요 원인이라고 볼 수 있다. |
