| 초록 |
본 연구에서는 꿀벌 진균성 질병인 백묵병의 보다 신속한 검출을 위해 새로운 진단방법으로 Quick Real-Time PCR을 도입하고자 하였다. Quick Real-Time PCR이란 PCR 및 용융온도 분석(Analysis of melting temperature)을 10분대의 완료시킬 수 있는 초고속 실시간 PCR 실험으로 본 연구에서 다른 실시간 PCR 방법과 구분하기 위하여 새로이 명명한 것이다. Quick Real-Time PCR 실험에 사용된 기기인 GenSpect TMC-1000™ System(삼성테크윈, Korea)은 열 전도가 높은 실리콘과 백금으로 이루어진 micro heater plate와 microchip을 기반으로 하고 있는 특수 tube를 채용하고 있으며, 이는 chip내 tube에 1㎕ 이하의 극소량 시료를 삽입하여 검출하는 방식으로, 주어진 온도변화에 따라 PCR 용액의 온도도 빠르게 변화가 가능하여 초당 20℃씩 온도가 증가 또는 감소될 수 있음이 확인되었다. 형광물질의 종류는 기존의 Real-Time PCR에서 가장 많이 사용되는 저렴한 SYBR Green을 사용하며 PCR 생성물의 양을 실시간으로 분석할 수 있었다. Ascosphaera apis의 Quick Real-Time PCR 검출법을 위하여 PCR 반응시간의 단축은 중요하기에, polymerization 시간을 단축하기 위하여 새로운 특이 primer를 설계하여 짧은 PCR 생성물을 만들도록 하였다. 이 primer들은 QP-A. apis F/QP-A. apis R이라 명명하였으며, PCR 검출에서 148 bp의 A. apis 특이 PCR 생산물을 생성하게 하였다. 이 염기서열은 GenBank의 M83264 서열 중 1331-1478에 해당되는 것으로 본 실험에서는 87.5℃의 melting temperature를 나타내었다. 생성된 product의 전기영동을 통한 분석에서는, 24개 분자의 Ascosphaera apis 16S 유전자(즉, 100ag의 template DNA)를 PCR 반응의 초기 기질양으로 사용한 실험에 대하여도 148 bp의 단일 PCR 생성물을 만들어 지는 것이 확인되었으나, 확실한 진단과 정확한 정량을 위하여 최소 1 femtogram (240개 DNA 분자) 이상 10 pg 이하의 기질이 필요한 것으로 판단하였다. Quick Real Time PCR에 의한 최소 진단소요시간은 PCR 증폭 및 Melting temperature analysis를 포함하여 17.5분으로 나타났으며, 이는 기기의 발달 및 기술의 진보에 의하여 보다 더 단축될 수 있을 것으로 기대되며, 본 연구에서 사용된 Quick Real Time PCR의 용어는 이를 염두에 두고 명명한 것이다. 이 10분대에 정밀검사에 속하는 PCR 검사를 마친다는 것은 현재 사용되고 있는 PCR 검사를 마친다는 것은 현재 사용되고 있는 간이검사법인 면역크로마토그라피법의 검사 소요시간에 버금가는 것이다. 실험실적 방법으로 알려져 있었던 PCR 실험법이 현장에서 사용될 수 있는, 즉 현장검사에서 사용되는 PCR 실험법으로 보다 폭넓은 활용이 가능할 것으로 기대하며, 아울러 이 Quick Real-Time PCR 법은 본 실험의 적용대상인 A. apis 뿐아니라 다른 병원체에 대한 PCR 진단에서도 폭넓게 적용될 것을 기대한다. |
