| 초록 |
목적: 단백질 분해효소 Neprilysin(NEP)를 표적으로 하는 약물의 고속대량스크리닝(High Throughput Screening) 모델을 구축하고, 이 모델로 억제제(Inhibitors)를 스크리닝한다. 기법: 피치아 효모 발현 시스템(Pichia expression system)을 이용한다. 재조합 플라스미드 pPICZα-A-NEP를 구축하고 발현 벡터와 효모균 X-33의 게놈 염색체 간 상동성 재조합을 유도한다. 그리고 외인성 유전자를 염색체에 통합하여 표적 단백질의 발현을 구현한다. 형광공진 에너지 전이법(fluorescence resonance energy transfer, FRET)으로 단백질 분해효소의 활성을 검사하고 반응 조건을 최적화한 후, 약물 스크리닝 시스템을 구축하여 억제제 스크리닝을 구현한다. 결과: 발현 벡터 pPICZα-A-NEP의 구축에 성공했다; NEP를 표적으로 하는 약물 스크리닝 모델을 구축하고 모델 반응의 동역학 매개변수 V max =3. 3.6 μM/s, K cat /K m = 4.5×10 5 M -1 s -1 을 얻었는데, 모델 Z-인자가 0.89로 확인되었다. 이 시스템은 안정성이 강하므로 NEP를 표적으로 하는 약물의 고속대량스크리닝에 사용할 수 있다; 또한 해당 모델을 응용하여 천연 산물의 성분 라이브러리를 스크리닝하고 0.5 mg/ml 약물 농도 조건에서 억제 비율이 비교적 높은 약물을 4종 얻은 후, 그의 50% 억제 농도(IC 50 )를 측정하였다. 그중에서 MDCNCL01000242의 IC 50 이 가장 낮았으며 (8.31±0.03) μg/ml로 확인되었다. 결론: 본 논문에서 구축한 약물 스크리닝 모델은 그 효과가 이상적이므로 NEP 억제제의 스크리닝에 적용되며, 약물 개발의 연구를 촉진할 수 있다. |
