| 저자(한글) |
DONG, Le,YAO, Li-mei,DAI, Cong-jie,ZHANG, Le,HUANG, Ping-ping,WANG, Jian-ying |
| 초록 |
본 논문은 부세(Larimichthys crocea)의 β-액틴(β-actin) 유전자(LcActb)를 내부 참조 유전자(internal reference gene)로 하여 관련 연구 진행 가능성을 탐구하기 위해 전사(transcription) 및 번역(translation) 수준에서 LcActb의 조직 발현 프로파일(tissue expression profile)을 연구하였다. 연구 과정에서 부세의 간(liver)을 재료로 하여 LcActb의 개방형 해독틀(open reading frame, ORF) 서열을 증폭하였으며, 또한 해당 서열을 원핵 발현(prokaryotic expression) 벡터에 서브 클로닝(subcloning)하였다. 효소 절단(enzyme digestion) 및 서열 측정을 진행한 결과, pET32a-LcActb가 성공적으로 구축되었다. pET32a-LcActb를 대장균 BL21(DE3)에 전환하여 최적화 발현 시켰고, 발현 단백질을 정제한 후 웨스턴 블로팅(Western blotting) 검증을 진행하였다. 원핵 발현 결과, IPTG는 분자량이 약 45 ku인 특이적 단백질을 유도할 수 있었고, 주로 봉입체(inclusion body) 형식으로 존재하였으며, 최적화 발현 조건은 28℃, 0.4mmol/L IPTG, 200 r/min에서 5시간 유도 발현하는 것이었다. 발현 단백질을 항원으로 하여 뉴질랜드 흰토끼(New Zealand white rabbits)를 면역시켜 LcActb 저항성 다클론 항체를 제조하였다. 그리고 정제한 다클론 항체를 이용하여 웨스턴 블로팅 검증을 진행한 결과, 특이적 LcActb 항체가 생성되었다. 실시간 형광정량 RT-PCR 검사로 부세의 각종 조직에서 mRNA의 발현을 검사하였으며, 다음으로 각종 조직 균질액 단백질(tissue homogenate protein)을 제조한 후 정제한 항체를 이용하여 웨스턴 블로팅 분석을 진행한 결과, LcActb가 성숙된 부세의 각 조직에서 전사 및 발현 차이는 모두 뚜렷하지 않았다. 그러므로 LcActb를 성숙된 부세의 각 조직에서 기타 유전자의 발현 및 번역 수준을 연구하는 내부 참조 표준으로 이용할 수 있다. |
