| 저자(한글) |
DONG, Bing-xue,NIU, Qiu-hong,ZHANG, Wei,GENG, San-chun,LI, Peng,YUAN, Wan-li,GONG, Yi-feng,LIANG, Ke-wei |
| 초록 |
【목적】Pichia pastoris를 이용하여 재먹물버섯 페록시다아제(Coprinus cinereus peroxidase, CIP)를 효과적으로 발현시키고자 한다. 【방법】DNAworks 3.1 소프트웨어를 이용하여 프라이머를 설계하고 최적화한 후, 자체적으로 구축한 유전자 합성, 부위 특이적 돌연변이(site-specific mutagenesis) 플랫폼을 이용하여 Pichia pastoris의 코돈이 선호하는 재먹물버섯 페록시다아제 유전자를 합성하고 서열을 측정하였다. 다음, 이를 발현 벡터 pPICZαA에 구축하고 Pichia pastoris GS115 염색체에 삽입하여 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae)에서 얻은 α인자를 신호 펩티드 서열로 하여 재조합 단백질의 분비 발현을 유도하였다. PCR 검사에서 양성을 나타낸 82개 효모 형질전환체로부터 6주의 높은 Zeocin 항성을 갖는 균주를 선별하여 발현시킨 후, 발현 효소의 활성이 가장 높은 것을 선택하여 실험 균주로 하고 CIP/GS115으로 명명하였다. 【결과】ABTS를 기질로 하였을 때, CIP/GS115는 메탄올로 유도한 네번째 날에 그 효소 활성이 가장 높았는데, 487.5 U/mL에 달하였다. 현재 진탕 플라스크에서 배양하여 발현을 유도한 것 중에서 재먹물버섯 페록시다아제의 활성이 가장 높다고 보고하였다. 정제한 후, 효소의 최적의 반응 온도는 25℃였으며, 45℃일 때 효소의 반응 속도는 최적 온도 시의 61.5%였다. 40℃보다 낮을 때 비교적 안정적이었으며, 45℃보다 높을 때 안정성이 신속하게 낮아졌다. 최적의 반응에 필요한 pH는 5.0, pH 4.5-6.5일 때 비교적 안정적이었다. 다양한 기질로 순수한 효소의 특이성을 연구한 결과, 최적의 기질이 ABTS gt; 구아야콜(guaiacol) gt; 2,6-디메톡시페놀(2,6-dimethoxyphenol) gt; 2,4- 디클로로페놀(2,4-dichlorophenol) gt; 페놀 순이라는 것을 발견하였다. 【결론】재먹물버섯 페록시다아제의 Pichia pastoris 내 효과적인 분비 발현과 높은 특수 활성은 해당 효소의 폐수 처리, 염료 탈색 등 측면의 산업화 응용을 위하여 기반을 마련하였다. |
