| 초록 |
다수의 치료적 항체들의 활성이 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC)에 의하여 부분적으로 매개된다. ADCC 활성을 정량화하는 전통적인 방법들은 노동집약적이고 높은 수준의 고유 변수를 갖는다. 이는 부분적으로는, 표준화하기 어려운, 복잡한 단점(endpoint)의 사용, 즉 세포독성 및 효과기 세포들로서 다른 기증자들(donors)로부터의 주요 인간 NK-세포들의 사용 때문이다. 이들 제한들은 NFAT 반응성 리포터 유전자의 활성화에 의하여 타겟 세포들 상에 발현되는 특정 항원에 결합된 항체의 Fc 모이어티의 라이게이션에 반응하는, 낮은 친화도 Fc 수용체, FcγRIIIa (CD16)를 발현시키는 조작된 효과기 세포주의 사용에 의하여 부분적으로 극복될 수 있다. 신규 재조합 효과기 세포주가 기재되며, 여기에서 반딧불이 루시페라제 (FL) 리포터 유전자가 조작된 타겟 세포들과 함께 ADCC 분석에 사용될 때, NFAT 조절된 리포터-유전자를 발현시키는 조작된 효과기 세포주들에 상대적으로, 개선된 민감도, 개선된 역동 범위, 인간 혈청에 대한 개선된 용인 및 감소된 배양 시간을 부여하는, NF-AT, AP1, NFkB, 및 STAT5에 대한 결합 부위들을 포함하는 신규 합성 키메라 프로모터에 의하여 조절된다. 타겟 세포들은 치료적 항체에 의하여 인식되는 특정 항원의 변함없이 높은 수준을 과발현시키도록 조작되었고, 그 안에서 특정 약물 타겟을 코드하는 유전자가 게놈 편집에 의하여 무효화된 동종 대조군 세포들이 개발되었다. 그 안에서 CD20을 코드하는 유전자가 무효화된, 동종 대조군 Raji B-세포주과 함께 변함없는 수준의 CD20을 과발현시키도록 조작된 B-세포주 Raji에 근거하여 신규 타겟 세포들이 인간 혈청으로부터 최소의 간섭 및 높은 정도의 정확도로 리툭산(Rituxan)의 ADCC 활성을 정량화하는데 사용되었다. 항-TNFα 단일클론 항체들의 ADCC 활성의 정량화를 위하여 타겟 세포주를 확립하기 위하여, 부위 특이적 돌연변이 유발이 TNFα의 프로테아제 절단 부위를 돌연변이시키는데 사용되어, 타겟 세포들이 막-결합된 절단되지 않는 TNFα를 발현시킨다. 이웃한 세포들의 표면 상에 제시되는 TNFαRII 수용체에 결합하는 HEK293 타겟 세포의 표면 상에 발현되는 절단되지 않는 TNFα가 세포사를 야기하는 것을 방지하고, 그러므로 영구적인 세포주의 확립을 방지하기 위하여, TNFαRII 수용체가 게놈 편집을 이용하여 무효화되었다. 여기에 기재된 막 결합된 TNFα를 발현시키는 타겟 세포들 및 재조합 효과기 세포들이 TNFα 길항제들로 치료된 류마티스 관절염 및 크론병 환자들로부터의 혈청 샘플들에서 치료적 항체들의 ADCC 활성을 정량화하는 방법을 개발하는데 사용되었다. ErbB2는 HEK293 및 SKBR3 세포들 둘 다에서 과발현되었고, 그 안에서 erbB2를 코드하는 유전자가 CRISPR-Cas9 게놈 편집에 의하여 불활성화되는, 동종 대조군 erbB2 음성 타겟 세포들이 트라스투주맙의 ADCC 활성의 정량화를 위한 대조군 타겟 세포들 및 타겟 세포들을 제공하기 위하여 확립되었다. 재조합 타겟 세포들이 또한 세툭시맙의 ADCC 활성의 정량화를 위하여 확립되었고, 그 안에서 EGF 수용체가 HEK293 세포들에서 과발현되었다. 원래의(native) HEK293 EGFR 음성 세포들이 동종 대조군 세포들로서 사용되었다. |
