| 초록 |
ㅇ 연구개요 본 제안과제에서는 대표적 유지효모인 Yarrowia lipolytica의 대사공학에 필요한 신규합성생물학 도구로써 OLIVE (OLeaginous yeast Innovative VEctor) toolbox를 개발하고자 함. OLIVE toolbox를 이용해 Y. lipolytica의 생리 시스템을 대사, 조절, 세포소기관 등의 다양한 수준에서 정교하게 제어함으로써, 고부가가치 지방산유도체 및 이소프레노이드 화합물 대량 생산을 위한 유지효모 세포공장을 개발하는 것을 목적으로 함 ㅇ 연구 목표대비 연구결과 1,2 차년도 에는 OLIVE toolbox 개발을 위해서 I) CRISPR-dCas9 mediated gene repression/activation 기술을 확보하고자 Mxi1과 VPR을 dCas9 단백질과 결합시킨 벡터를 제작 및 유전자 발현의 변화를 확인함. II) Ribozyme 기반 multiplexing 기술을 개발, 세포 성장 차이로 기술의 유효성을 검증하였으며 dCas9-effector protein과 RNA-directed gene expression 시스템을 개발함. III) 배양 조건에 따른 세포생장 및 지질 축적 프로파일을 분석하고 전사체 데이터 확보를 위해 FACS 스크리닝 기법을 활용함. IV) eMOMA 알고리즘을 활용, 유지 효모의 지질 축적현상을 분석하고 유효한 균주 설계에 성공하였음. V) 유전자 발현 정밀 제어를 위해 전사 조절 유전자인 FadR을 활용한 orthogonal promoter를 구축함으로써 operator sequence의 개수 변화를 통해 promoter의 세기를 조절하는 기술력을 확보하였음. VI) 목적 산물인 베타-카로틴과 유리 지방산을 생산할 수 있는 생산 균주를 대사 공학을 통해 확보하였음. 상기한 내용은 1,2차년도 목표인 OLIVE toolbox 완성에 필요한 기초 기술의 내용이며 본 연구진은 OLIVE toolbox를 위한 기초 기술 개발에 성공하였음. 3,4차년도 에는 OLIVE 스크리닝 시스템을 기반으로 I) 유지 효모의 대사 경로를 최적화, 카르테노이드/리시놀레산/락톤의 생산 경로를 최적화하여 각 산물의 생산성을 극대화하였고, II) 세포 내 지방산 농도에 따라 활성이 최대 14배 증대되는 합성 프로모터를 개발, 수산화 지방산 생산 경로에 적용하여 당으로부터 160mg/L 수산화지 방산을 생산하였음. III) 세포 소기관(퍼옥시좀) 동역학에 관여하는 16개 유전자에 대한 발현 조절을 통해 형태 변화를 관찰하고, 감마-데카락톤의 생산 증대에 영향을 주는 pex3 유전자를 발굴함. 또한, 델타-데카락톤을 생산하기 위한 왜래 CYP를 도입할 때 OLIVE vector를 사용하여 cytoplasm, ER, peroxisome에 각각 발현함으로써 델타-데카락톤의 주요 생합성 경로인 베타산화가 일어나는 peroxisome에서 발현할 때 최대로 생산성이 증대되는 것을 확인하였음. IV) 6개의 POX 유전자의 발현을 조절하고, 반복적인 스크리닝을 통해 리시놀레산으로부터 가장 높은 생산성을 보이는 감마-데카락톤 생산 균주를 확보했으며 bioreactor를 사용하여 2g/L의 감마-데카락톤 생산하는 데 성공하였음. 또한, 리시놀레산 생산 균주를 확보하기 위해 MFE1, PEX10, FAD2, DGA1 유전자를 제거하고 유지 효모의 NHEJ를 적극 활용하기 위해 homology-independent genome integration 벡터를 제작하여 CpFAH12 카세트를 삽입하였음. 리시놀레산 생산 추가 증대를 위해 DGA2, ARE1, PAH1, APP1, DPP1, LPP1, OPI1을 제거함으로써 경쟁 경로를 차단하면서 포스타티딜인산의 양을 늘리고자 하였고, 인지질 생합성과 합성 원료합성에 관여하는 CDS1과 CTP synthase 유전자를 과발현 하였음. 또한 생산 배지 최적화를 통해 약100mg/g DCW의 리시놀레산 생산을 달성함. 또한, APP1, MHY1, FAD2 유전자 발현을 조절하여 세포내 지질 축적과 지질의 비율을 조절할 수 있었음. 상기한 연구 결과들을 통해, 제안 과제의 최종 목표인 OLIVE tool을 완성하고, 이를 활용한 생리 시스템 다수준 최적화, 세포공장 구축 및 고부가가치 산물 생산 즉 유지 효모 기반 oleo-biorefinery 구축을 성공적으로 이뤄내었음. ㅇ 연구개발성과의 활용 계획 및 기대효과 (연구개발결과의 중요성) 대사공학을 위한 스크리닝과 유전자 정밀 발현을 가능하게 하는 2개의 vector system으로 이루어진 OLIVE toolbox는 모델 유지 효모로 알려진 Y. lipolytica에는 부족한 정밀 유전자 발현 제어 도구를 발전시켰으며 특히 합성 프로모터의 개발로 유전자 발현 다단계 조절을 한층 용이하게 하였음. 또한, 모델 효모인 S. cerevisiae에 비해 부족했던 유전자 조작 방법, 지질축적 기작에 대한 이해도를 넓힘. Y. lipolytica는 진행생물로서 다양한 세포 소기관을 가지며, 다양한 목적 산물 대사경로들이 소기관에 산재되어 있음. 또한, S. cerevisiae 에 비해 풍부한 acetyl-CoA pool을 갖기 때문에 지방산유도체 및 카로티노이드 대량생산에 매우 적합한 균주임. OLIVE toolbox는 Y. lipolytica의 대사 및 유전자 전사 조절, 세포 소기관 최적화를 가능하게 하는 시스템으로서 고부가가치 지방산유도체 및 이소프레노이드 화합물 대량 생산을 위한 세포 공장을 만들어 내었음. 이는 석유자원의 고갈 및 신 기후체제 출범에 대한 대응할 수 있는 훌륭한 Oleo-biorefinery로 사용될 가능성이 충분함. (출처 : 연구결과 요약문 2p) |
