| 초록 |
Ⅳ. 연구개발결과 1. Laccase 유전자 확보 가. 확보된 바실러스 균주의 게놈으로부터 Laccase 유전자 확보 - 다양한 Laccase 효소자원을 수집하기 위하여 총 126주의 바실러스 균주를 수집하였고 이들에 대해 항진균 활성 및 항세균 활성을 측정하였음. - 그 결과 29종의 바실러스 균주가 곰팡이 Rhizoctonia solani에 대한 항진균 활성을 보였고 32종이 Botrytis cinerea에 활성을 보임. 그람양성균인 Micrococcus luteus에 대한 항세균 활성을 보인 균주는 20종이었음. - 알려진 여러 바실러스 종의 laccase 유전자 염기서열을 확보하여 비교한 결과 homology가 많이 다름을 알 수 있었는데, 이는 바실러스 laccase가 종마다 서로 다른 염기서열을 가진다는 것을 알 수 있음. - 바실러스 균주로부터 총 26종의 laccase 유전자를 확보하였고, 기 확보된 바실러스 발현시스템을 이용하여 바실러스 서틸리스 168 균주에서 6종의 laccase 유전자를 과발현하였음. 나. Laccase의 특성 분석 - 과발현된 6종의 laccase 유전자 중, 바실러스 서틸리스 laccase에 대한 특성을 분석하였음. - Laccase는 세포 내에서 발현되는 단백질이므로 발현된 단백질의 효율적인 회수를 위하여 단백질이 세포 밖으로 분비될 수 있도록 단백질 분해효소 (aprE)의 signal peptide를 붙여 발현하였음. 그 결과 세포 내에서만 laccase가 과발현됨을 확인하였음. - Laccase가 세포 내에서 발현되는 단백질이나 대부분 효소 활성이 상등액에 존재하는 것으로 보아 laccase가 세포 내에서 발현되었지만 자가분해 (autolysis)에 의해 세포 밖으로 분비된 것으로 생각됨. - 바실러스 서틸리스에는 8개의 세포외 단백질 분해효소 (extracellular proteases)가 존재하여 발현된 단백질이 쉽게 분해될 수 있음. - 8개의 세포외 단백질 분해효소가 결핍된 WB800N 균주에서의 효소 활성과 바실러스 서틸리스 168의 효소 활성이 비슷한 것으로 보아, laccase가 세포외 단백질 분해효소에 의해 쉽게 분해되지 않음을 확인하였음. 과발현된 laccase를 상온에서 30일 이상 보관하여도 효소 활성이 유지되는 것을 확인하였음. - Laccase를 다양한 유기용매들과 상온에서 2시간 반응시킨 뒤 효소 활성을 검정해본 결과, 에탄올, 2-propanol, 아세톤, triton X-100에 대하여 그 활성이 유지됨을 확인함. - 상업적 발현벡터 (pHT01)를 이용하여 제작한 laccase 발현 균주와 본 연구에서 사용한 laccase 과발현 균주의 효소 발현 정도를 비교해보고자 함. - 본 연구의 발현 시스템을 이용한 균주와 상업적으로 판매되는 발현 벡터를 이용한 균주의 효소 활성을 측정해 본 결과, 본 연구팀의 발현시스템을 이용한 균주의 효소 활성이 상업적으로 판매되는 벡터를 이용한 효소 활성보다 약 10배 이상 높게 나타남. - 포자형성 배지에서 균주 배양 후 포자 표면에서의 효소 활성을 비교한 결과, 상업적 발현 시스템에 의한 효소 활성보다 본 연구의 발현시스템에 의한 효소 활성이 10배 이상 높게 나타났음. 과발현된 laccase는 120시간까지 포자 표면에서 잘 발현되며 활성이 안정하게 유지됨. - laccase가 화학물질을 분해하는지 알아보기 위해 염색시약인 indigo carmine과 laccase 과발현 균주를 반응시킨 후 과발현한 laccase가 indigo carmine을 모두 분해시킴을 확인하였음. 다. 유기인계화합물 가수분해효소 (OPH)의 과발현 - 생물학적 환경정화 (bioremediation)는 미생물, 곰팡이, 식물 또는 그 효소를 이용하여 오염 물질을 제거하는 방법임. - 최근 유기인계화합물의 분해에 효소를 이용한 생물학적 처리 방법들이 관심을 받고 있음. 그 중, 유기인계화합물 가수분해효소 (OPH)는 |
