| 초록 |
□ 연구개발목표 및 내용 ■ 최종 목표 - 본 연구개발을 통해서 들기름을 기본으로 여러 천연물 소재를 추가적으로 조합함으로써 난임의 임상적 미충족 수요 중 핵심적인 자궁 내막수용력을 증진할 수 있는 최적의 조합을 찾고, 들기름을 포함하는 복합물의 착상증진을 통한 난임 개선을 할 수 있는 건강기능식품의 개발을 위하여 세포실험 및 동물실험을 통한 전임상 기초 효능 자료를 확보함. - 나아가, 이후 본 연구 개발의 결과로 전 임상실험을 통한 과학적인 자료와 안전성 확보된, 소재로서 새로운 고부가가치 들기름 복합물이 자궁 건강 개선용 건기식으로 난임에 효능 있는 제품화로 진행 ■ 전체 내용 세부 연구개발 목표, 개발 내용 및 방법 ◦ 최적 조합의 자궁내막 수용력 증진 효능 확인 - In vitro system 들기름을 포함한 천연물 후보 소재의 최적의 조합 발굴 i) 들기름을 포함한 천연물 소재 중 들기름+애엽, 들기름+천궁, 들기름+애엽+천궁 조합을 이용하여 자궁내막 세포 수용력 증진 효능을 확인함. ii) in vitro에서 착상효율을 평가하기 위한 모델로는 인간유래 자궁내막세포(Human endometrial epithelial cell)로는 수정란과의 결합력이 있는 것으로 알려진 Ishikawa cell를 사용하고, 영양막세포(Trophoblast)로는 JAr cell을 이용함. iii) 자궁내막세포주로는 Ishikawa와 영양막세포주로는 JAr를 확보하고 있으며, 세포간 접착을 확인하기 위한 실험조건을 선행연구를 통하여 확립함. iV) Ishikawa cell 에서 후보 소재 조합을 처리하고 JAr cells는 결합시키기 전 CellTracker™ Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)로 염색하여 두 세포간의 접착능을 형광현미경으로 확인함. V) 그리고 Ishikawa cell에 후보 소재 조합을 처리하고 LIF와 세포간 접착분자(adhesion molecules: 인테그린 등)의 발현을 증가시키는지 RT-PCR, qPCR을 통해서 확인함. ◦ 착상 억제 동물 모델을 이용한 유효성 검증 - 착상 억제 In vivo 모델을 이용한 최적 조합 후보소재의 착상 증진 효능 확인. i) 여러 가지 논문을 바탕으로 프로게스테론 수용체 antagonist인 RU486을 이용하여 착상 억제 마우스 모델을 수립함. ii) 최적의 조합 후보소재를 마우스의 구강으로 14일간 투여하여 착상 억제 모델에서 착상이 증진되는 효과를 마우스 태아의 수로 확인함. iii) 착상 억제 마우스에서 착상 평가기준 표준화 마련. · 실험동물 :C57BL/6N 마우스(6주령)를 female과 male(1:1)로 오리엔트 바이오사에서 구입 후 1~2주일간 적응. (사육조건: 온도 23±2℃, 습도 55±5%, 명암 12시간 단위 조정, 물과 사료 자유급식). · 최적의 조합 후보소재 처치 : 무작위로 군 배정(8~10마리). 후보소재의 하루 투여 양을 정하고, 14일간 zonde로 경구 투여함. ※ 한약재의 투여 기준농도(1X)의 결정: 성인(60kg) 기준 한약재 하루 섭취량. 성인 (60kg) 기준 : 8g X 2 = 16g (하루 섭취량) 16g/60kg X 한약재 수율(%) => 1X라고 정함 그것에 대한 0.5X, 1X, 2X군을 농도 의존적으로 나눔. · 최적의 후보소재를 투여하고 5일후 PMSG(10IU) 투여후 48시간 뒤 hCG(10IU)투여함. 그리고 암수합사(female:male=1:1)함. 다음날 plug 확인. 암수합사 4, 5, 6, 7일 후 4번 RU486(0.08mg)을 피하주사를 하고 마지막 날 male을 분리함. 그리고 다음날 sacrifice하여 자궁을 적출함. · 적출한 자궁을 사진을 찍은 후 조직학적으로 자궁 조직을 포르말린에 고정하여 한 후 병리표본을 제작하고, H&E 염색을 통하여 착상된 배아의 수를 계상하고 면역조직화학(IHC)염색을 통하여 LIF, adhesion molecules 등 착상과 관련된 단백질의 발현여부를 염색을 통하여 확인함. GraphPad prism (GraphPad software, USA)의 Student's t-test을 사용하여 통계 분석함. · 실험스케줄 도식화 : 최적의 후보소재의 RU486을 이용한 착상억제모델에서 실험스케줄 ◦ 시제품 제작 - 최적 조합 후보 소재 추출 공정 표준화 i) 최적의 복합물 조성 비율 설정, 실험실 스케일의 제조 시료 확보 in vitro 활성 확인 결과에 따라 제조공정 방향성 확정 ii) 소재의 추출 방법 확립과 지표성분의 함량 확인 : 주요 공정별 수율 변화 및 지표성분 3종의 함량 확인 □ 연구개발성과 * 천궁, 애엽, 들기름 추출물, 들기름+애엽, 들기름+천궁, 들기름+애엽+천궁 복합물을 자궁내막 세포주에 처리하여 자궁내막 세포주의 독성을 확인하고, 자궁내막 수용력 증진에 대한 LIF발현과 세포세포간 접착인자인 인테그린의 αV/β3/β5 발현을 확인하였을 때 들기름+애엽+천궁 복합물이 LIF발현과 세포세포간 접착인자인 인테그린의 αV/β3/β5 발현 증가에 효능이 좋은 것으로 확인됨. * 또한 들기름+애엽+천궁 복합물이 자궁내막 세포주와 태아 유래의 영양막 세포주의 유착이 증가됨(착상 효능 증가)을 확인. * RU486을 처리한 착상억제 동물모델에서 들기름이나 들기름+애엽 보다 들기름+애엽+천궁 군에서 착상 증진에 효능에 따른 임신배아수가 증가하고 있음을 보여줌. * 들기름+애엽+천궁을 시제품을 만들기 위한 각 천연소재의 표준 지표물질 설정(알파-리놀렌산, eupatilin, Ferulic acid) * 들기름+애엽+천궁 조합의 착상증진에 관한 진보성 특허 출원 준비중 추가적으로 기전 규명 데이터를 확보하여 SCI(E)논문을 게재 예정 □ 연구개발성과 활용계획 및 기대 효과 - 본 연구를 통하여 가임기 여성의 들기름을 포함한 천연 기능성 소재군을 통해 자궁내막 수용력 증가를 통한 자궁내막 착상 증진이 개선됨으로써 들기름 복합물의 자궁 내막 기능 개선을 과학적으로 확인하여 자궁내막 수용력 증가로 결국에는 임신효율을 증가시키는 목적으로 활용할 수 있는 과학적 근거를 제시하고, 들기름 복합물 조합의 최적의 비율로 실험실 스케일 시제품 제조 및 활성 확인을 목표-조합군 결과 특허 출원 및 SCI(E)논문 발표를 통한 결과의 과학적 객관성 및 기술의 신규성과 독립성 확보함 - 향후, 기업 제품화를 위한 시제품 독성 및 임상시험 진행 도전. 들기름 복합물의 안정성 확보를 통해 난임 극복에 이용될 수 있는 건강기능식품 또는 천연물 의약품 개발 가능 - 앞으로 사람들이 쉽고 안전하게 접하는 건강기능식품의 확대가 기대됨에 따라 여성 자궁건강 개선을 통한 난임 개선에 효능이 있는 식품 및 건강기능식품 개발은 보건사회 문제를 해결하는 중요한 관심이 될 것임. - 난임개선에 효능이 있음이 과학적으로 증명되어 임상에서 활용된다면 새로운 시장 창출과 함께 국가적인 난임지원 사업에 참여할 수 있는 계기가 될 것으로 사료됨. - 난임의 의약품, 의료기기 시장도 2010년 35억불 규모에서 2017년 48억불로 성장하였음. 호르몬제로 대부분 국한되어 진정한 의미의 난임 개선 효능을 가진 의약품으로 볼 수 없음. 건강기능식품은 전무 - 최근 중국의 경우 난임 진단자가 5천만명에 이를 것으로 추정. 최근 2자녀 허용 정책의 영향으로 난임 클리닉을 찾는 여성이 급증하고 있는 추세 - 그래서 기존 중국 시장 판로를 활용하여 식품 시장 진입 및 특허를 기반으로 기술개발 진행하여 난임 개선용 건강기능식품 시장을 우선 중국 수출이 가능 할 것으로 사료됨 (출처 : 요 약 문 3p) |
