| 초록 |
□ 연구개발 목표 및 내용 ○ 최종 목표 기능성 성분이 강화된 십자화과 작물 육종 소재 개발 - 기능성 성분 생합성 연관 유전자편집 십자화가 개체 선발 - 기능성 성분 고함량 유전자편집 개체 선발 ○ 전체 내용 ○ 유전자편집 기술 개발 - 브로콜리/양배추의 글루코라파닌 생합성에 관여하는 MYB28 유전자와 글루코라파닌 분해에 관여하는 AOP2 유전자를 목표 유전자로 선정하여 sgRNA 를 제작함. - Cas9 단백질과 sgRNA를 활용한 RNP 유전자편집 기술 및 Agrobacterium과 CRISPR/Cas9 이 bunary vector 에 도입된 유전자편집용 construct를 활용한 유전자편집 기술을 개발함. ○ 브로콜리/양배추 재분화기술 개발 - 브로콜리/양배추에서 분리된 원형질체에서 callus, shoot, root를 유도하는데 적합한 배지 조성과 처리 조건을 확인함. - 브로콜리/양배추에서 stem explant 에서 callus, shoot, root를 유도하는데 적합한 배지 조성과 처리 조건을 확인함. ○ 유전자편집 기술 적용 - 상기의 개발된 기술을 활용하여 브로콜리/양배추 원형질체와 explant를 대상으로 유전자편집 기술을 적용함. - 브로콜리/양배추에서 분리한 원형질체를 대상으로 PEG 처리를 통해서 MYB28과 AOP2 유전자 편집을 적용함. - 브로콜리/양배추 stem explants 에 MYB28과 AOP2 유전자 편집용 binary vector에 형질전환된 Agrobacterium을 접종하여 유전자편집을 실시함. - 유전자편집 실시 후 확보된 재분화된 조건을 적용하여 유전자편집이 적용된 stem 유래의 explants 와 원형질체에 대해 재분화를 시도함. - 재분화된 브로콜리/양배추 개체 (T<sub>0</sub>)는 순화 처리 후 토양으로 정식됨 ○ 유전자편집 개체(T<sub>0</sub>) 형질전환 여부 분석 - 유전자편집 개체 개발에 상용된 항생제 마커(Basta) 를 선발할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 실시하여, Basta gene 에 해당하는 PCR 증폭산물이 확인되면 유전자편지용 벡터가 도입된 것으로 판단하여 확인된 개체를 GMO 포장에서 화분재배하면서 특성 평가와 T<sub>1</sub>종자 채종을 실시함. ○ 유전자편집 개체(T<sub>0</sub>) 유전자 편집 여부 분석 - 형질전환이 확인된 T<sub>0</sub> 유전자편집 개체 전체에 대한 유전자편집 여부를 확인하지는 않았지만, 일부 T<sub>0</sub> 유전자편집 개체를 대상으로 염기서열 분석을 실시하여 유전자편집 여부를 일부 확인하여, GMO 포장에서 재배된 개체에 대해서 특성 평가를 실시함. ○ 유전자편집 개체(T<sub>0</sub> ) 대상의 글루코라파닌 함량 분석 - 유전자편집이 확인된 T<sub>0</sub> 개체를 대상으로 글루코라파닌 함량 분석을 실시하였음. - 화뢰/결구 형성에 오랜 시간이 걸리므로 잎 조직에서 글루코라파닌함량 분석을 실시하여 글루코라파닌 함량이 증가된 개체를 선발함. ○ 유전자편집 브로콜리 개체(T<sub>0</sub>)에서 T<sub>1</sub> 종자 채종 - 상기에서 확보된 유전자 편집 T<sub>0</sub> 개체를 포장에 정식하여 영양생장이 충분히 이루어지도록 표준재배법을 적용하여 재배함. - 영양생장이 완료되고 화뢰가 형성되기 시작하면 채종을 위한 준비를 시작함. 하절기에는 4℃ 저온창고에서 저온처리를 한 후 재배온실로옮겨 화아 형성을 유도하고, 동절기에는 별도의 저온처리 없이 재배포장에서 직접 화아 형성을 유도함. - 화아가 형성되면 유전자편집에 사용된 유전자원에 따라서 적절한 뇌수분(Bud crossing 혹은 Bud selfing)을 실시하여, 종실 발달이 되는지 관찰하여, 최종적으로 발달된 종실을 수확하여, T<sub>1</sub> 종자를 채종함. ○ 유전자편집 양배추 개체(T<sub>0</sub>) 에서 T<sub>1</sub> 종자 채종 - 상기에서 확보된 유전자 편집 T<sub>0</sub> 개체를 포장에 정식하여 영양생장이 충분히 이루어지도록 표준재배법을 적용하여 재배함. - 영양생장이 완료되고 화뢰가 형성되기 시작하면 채종을 위한 준비를 시작함. 하절기에는 4℃ 저온창고에서 저온처리를 한후 재배온실로 옮겨 화아 형성을 유도하고, 동절기에는 별도의 저온처리 없이 재배포장에서 직접 화아 형성을 유도함. - 화아가 형성되면 유전자편집에 사용된 유전자원에 따라서 적절한 뇌수분(Bud crossing 혹은 Bud selfing)을 실시하여, 종실 발달이 되는지 관찰하여, 최종적으로 발달된 종실을 수확하여, T<sub>1</sub> 종자를 채종함. ○ T<sub>1</sub> 종자 발아 후 T<sub>1</sub> 유전자편집 개체 선발 - 수확된 T<sub>1</sub> 종자의 1/2은 주관기관에서 항생제 배지에서 유전자편집개체를 선발하는 작업을 실시하고, 선발된 개체에 대해서는 유전자편집 여부 확인과, homo, hetero 라인 확인하는 작업을 실시함. - 선발된 T<sub>1</sub> 유전자편집 개체는 GMO 포장에서 재배하면서 특성평가를 진행하고, 화뢰 및 결구가 수확되면, 글루코라파닌 정량분석이 실시됨. ○ 유전자편집 브로콜리 T<sub>1</sub> 개체 특성 평가 - 수확된 T<sub>1</sub> 종자의 1/2은 협동기관 자체적으로 재배 평가를 실시함. 즉 GMO 포장에서 화분 재배하면서 화뢰 형성 시기, 화뢰 입자 크기,화뢰 색상 등의 원예적 형질들을 분석하였음. 특성 평가 후 우수하다고 판단되어 선발된 개체에 대해서 유전자편집 여부와 글루코라파닌 함량 분석을 실시함. ○ 유전자편집 양배추 T<sub>1</sub> 개체 특성 평가 - 수확된 T<sub>1</sub> 종자의 1/2은 협동기관 자체적으로 재배 평가를 실시함. 즉 GMO 포장에서 화분 재배하면서 생육과정 전반에 걸쳐 입성, 초장,식물체 크기, 결구 특성, 숙기 등 그 원예적 특성을 분석하였음. 특성 평가 후 우수하다고 판단되어 선발된 개체에 대해서 유전자편집 여부와 글루코라파닌 함량 분석을 실시함. ○ 브로콜리 T<sub>2</sub> 종자 채종 - 선발 T<sub>1</sub> 개체 대상의 T<sub>2</sub> 종자 채종 실시 ○ 소포자 배양을 통해 생산된 유전자 편집 개체 선발 - T<sub>0</sub> 변이체에서 추출한 소포자를 배양하면서 콜히친을 처리하여 MYB28/MYB28 혹은AOP2/AOP2 라인으로 고정시키는 작업을 병행 실시하여 단기간에 상기 유전자 변이가 고정된 라인을 조기에 확보하는 전략을 실시함. □ 연구개발성과 ○ 브로콜리 유전자편집 개체(T<sub>0</sub>) 확보 - MYB28 - 60, AOP2 - 95 ○ 양배추 유전자 편집 개체(T<sub>0</sub>) 확보 - MYB28 - 4, AOP2 - 37 ○ T<sub>1</sub> 종자 채종 - 확보된 브로콜리 MYB28 TO 개체 중 41 개체에서 T<sub>1</sub> 종자 채종 완료 - 확보된 브로콜리 AOP2 TO 개체 중 64 개체에서 T<sub>1</sub> 종자 채종 완료 - 확보된 양배추 MYB28 TO 개체 중에서 4개체에서 T<sub>1</sub> 종자 채종 완료 - 확보된 양배추 AOP2 TO 개체 중 28 개체에서 T<sub>1</sub> 종자 채종 완료 - 확보된 T<sub>1</sub> 종자 발아 후 포장 재배 실시 ○ T<sub>1</sub> 편집체 선발 - 상기에서 확보된 브로콜리 T<sub>1</sub> 종자 스크리닝 실시(중) - 상기에서 확보된 양배추 T<sub>1</sub> 종자 스크리닝 실시(중) ○ T<sub>1</sub> 편집체 포장 재배 및 특성 평가 - 상기에서 확보된 양배추/브로콜리 포장 재배 및 특성 평가 진행(중) ○ 글루라파닌 고함량 유전자편집체 선발 - 브로콜리 MYB28 유전자편집 개체(DNA free 편집체) - 1 개체 선발 - 양배추 AOP2 유전자편집 개체 - 5 개체 선발 □ 연구개발성과 활용계획 및 기대 효과 가. 기술적 측면 ○ CRISPR/Cas9 기술을 접목한 최신 분자육종 기술을 적용하여 신품종 육성에 걸리는 시간을 획기적으로 단축함 (전통육종 시 1 |
