| 초록 |
연구개발 목표 및 내용 최종 목표 < 주관: 유전자교정기술을 적용한 개화수명 연장 페튜니아 육종소재 개발 및 품종화 > ○ 본 연구과제의 최종목표는 1) 기 확보된 PhACO1 유전자 편집 페튜니아를 사용하여 세대 진전을 통한 벡터 제거 및 원예적 특성조사를 실시하여 조기 품종화를 추진함과 동시에 2) DNA-free RNP 활용 기술을 고도화하여 에틸렌 생합성에 관여하는 것으로 알려진 유전자 중 다른 두 개의 유전자를(PhACO3, PhACO4) 단독 또는 동시에 편집하여 피라미딩 함으로써 꽃의 수명이보다 안정적으로 연장된 유전자 편집 페튜니아를 개발하는데 있으며 세부 목표는 다음과 같다. - CRISPR/Cas9 system을 이용 페튜니아 에틸렌 생합성 관련 gene editing 벡터 구축 및 형질전환체 육성 - 페튜니아 원형질체 재분화 기술 고도화 및 DNA-free RNP 활용 유전자 편집 식물체 육성 - 유전자교정 페튜니아의 농업 및 원예적 특성 평가 및 품종화 < 공동: 십자화과 작물 개화 유전자 정밀 교정 및 추대조절 > ○ 본 연구과제의 최종목표는 십자화과 속 식물의 추대조절 유전자 편집을 통한 수확조절 및 생산성 증대이다. 따라서 본 연구는 1) 조추대 및 만추대성 십자화과 작물 유전자원 확보 및 개화 특성 분석을 통해 자원 간 화아분화 및 추대조절에 관련한 타겟 유전자 동정과 유전자 정밀 교정 도입을 위한 최대 변이효율 발생 잠재 부위 탐색, 2)유전자 정밀 교정 RNP 디자인 및 다양한 전달 방법 비교검증을 통한 양배추 유전자 교정 기술 확립, 3)개화 반응 및 조절인자 정밀 교정을 통한 변이체 유도 및 이를 기반으로 한 십자화과 작물의 확대 적용을 세부 목표로 수행되었다. 전체 내용 < 주관: 유전자교정기술을 적용한 개화수명 연장 페튜니아 육종소재개발 및 품종화 > ○ CRISPR-Cas9 적용 Targeted sgRNA 선정 & CRISPR-Cas9 발현을 위한 식물벡터 구축 - Sol genome networks (http://solgenomics.net)를 이용하여 핵심유전자들의 게놈 내인트론, 엑손영역을 분석하고 다양한 분석 softeware를 이용하여 유전자 구조분석을 분석함. CRISPR RGEN tools (http://www.rgenome.net/cas-designer/)을 이용하여 sgRNA(single guide RNA)를 각 유전자당 3개 씩 디자인 - 식물발현 벡터구축은 pBAtC vector(accession number KU213971)를 사용하여 합성한 PhMlo1유전자의 sgRNA를 벡터에 삽입(Kim 등, 2016)하고 구축된 plasmid를 Arobacterium tumefaciens LBA4404에 도입하여 페튜니아 형질전환에 이용. ○ Agrobacterium 방법을 이용한 형질전환 효율향상 기술 체계화 및 형질전환 식물체 육성 - 형질전환 실시하여 형질전환체 획득 및 기외순화 (연구 목적에 적합합 최적 변이체를 얻기 최소 벡터당 50개 이상의 형질전환식물체 line 육성) ○ 형질전환 식물체의 genotype 분석 및 선발 - NGS분석을 이용한 형질전환체의 genotyping을 통해 변이체 유형 및 효율 분석 - genotype 분석을 통해 고효율 형질전환식물체(homozygote) 최종 선정 및 효용성 검토 ○ 선발된 PhACO1, PhACO3, PhACO4 변이체로부터 에틸렌 발생량 및 개화수명 측정 - 유전자 편집 변이체를 대상으로 Xu 등(2019)의 방법에 따라 에틸렌 발생량과 개화수명 측정 - 유전자 편집 변이체를 대상으로 표현형 및 생육특성 조사 < 공동: 십자화과 작물 개화 유전자 정밀 교정 및 추대조절 > ○ 십자화과 채소작물 조추대 및 만추대성 양배추, 브로콜리, 콜라비 유전자원의 확보 및 개화특성 분석 - 국내 주요 십자화과 채소를 전문육종회사를 통해 최대 30~40 일간의 추대차이 특성을 보이는 조추대형과 만추대형 RIL 유전자원을 확보하였고, 확보된 자원을 활용하여 저온처리 후 추대, 개화유도와 연관된 저온 및 광반응 네트워트 내 유전자들의 발현 경향을 비교 분석하였고, 주요 개화 조절 유전자들의 관련성을 검증하였고, allele 변이체로 인한 개화차이를 유전자 동정과 구조적 변이를 통해 검증하였다. ○ 양배추 추대 차이 유전자원의 저온 및 광반응 개화조절 유전자 동정 및 기능검증 - 개화는 내부 및 외부 환경요인들에 의하여 조절되는 생리과정으로 광주기, 온도, 식물호르몬 및 식물 나이에 의하여 결정되는 것으로 알려져 있다. 이들 유전자 중 저온에 반응하는 Flowering locus C (FLC), Vernalization Insensitive 3 (VIN3),광반응 유전자 Gigantea (GI), CONSTANS (CO)를 대상으로 추대시기 차이를 보이는 양배추 유전자원에서의 전사단계 유전자 발현과 개화차이와의 연관성을 검증한 후 타겟 유전자의 gRNA를 디자인하여 제작하였다. ○ 양배추 원형질체 배양 기술 및 재분화체 유도 조건 확립 - 양배추 원형질체 배양을 통해 재분화체 확보를 위해 양배추 원형질체 분리, 원형질체 활성검증, 캘러스 및 기관분화 적합 배지선정, 호르몬 조합 결정, 그리고 최종 재분화체 확보 등 전과정에 걸친 최적화된 기반을 설계 하였다. 원형질체의 배양기술 및 재분화체 유도기술의 적합성을 검증하기 위하여 GFP 유전자 도입을 통해 31%의 TG 효율을 확인할 수 있었고, FDA test를 실시하여 안정적으로 세포벽이 형성되고 있음을 검증하였다 ○ 원형질체 기반 정밀교정 RNP 도입 및 아그로박테리움 매개 크리스퍼 변이 교정체 유도 - CRISPR/Cas9 시스템 기반 유전자 정밀 교정을 위해 FLC homologous유전자들과 VIN3 유전자 정보를 바탕으로 해당 유전자의 target 가능 site 조사를 통해 off-target 확률이 낮고 목적 부위 특이성이 높으며 out-of-frame score가 상대적으로 높아 절단 후 변이 효율이 높을 것을 예측되는 guide RNA를 제작 설계하였고, 양배추 원형질체를 기반 DNA-free RNP도입 방법과 아그로박테리움 매개도입 방법으로 타겟 유전자 교정을 유도하였다. 원형질체 세포전달의 경우 PEG와 전기충격법에 따른 변이 효율을 비교하였고, 아그로박테리움 매개 크리스퍼 벡터 전달의 경우 다양한 벡터 및 아그로박테리움 균주별 돌연변이 유도 효과를 비교하였다. ○ 원형질체 기반 정밀교정 RNP 도입 및 크리스퍼 변이 유도 - CRISPR/Cas9 시스템 기반 유전자 정밀 교정을 위해 FLC homologous유전자들과 VIN3 유전자 정보를 바탕으로 효율이 높을 것을 예측되는 guide RNA를 제작 설계하였다. 원형질체의 경우 PEG보다 전기충격법이 변이율 유도에 3x 이상의 높은 효율이 있음을 확인하였다. BoFLC, BoGI, 그리고 BoVIN3 타겟 RNP를 원형질체로 전달 후 Targeted deep sequencing 혹은 Sanger sequencing응 통해 원형질체 세포에서 +1bp 변이 원형질체 세포(최대 3% Indel 확인)가 존재함을 확인하였고, 현재 캘러스 유도를 거쳐 기관분화 과정에 있다. ○ 아그로박테리움 매개 개화조절 유전자 타겟 크리스퍼 변이 재분화 교정체 유도 - 개화반응 관련 유전자 BoFLC1과 메틸화를 통해 FLC의 전사억제하는 VIN3를 타겟으로 한 CRISPR/Cas9 시스템 기반 아그로박테리움 매개 정밀 교정체를 생산하고 변이 식물체의 재분화를 유도하였다. 재조합된 pBAtC::BoFLC1 sgRNA1벡터가 도입된 Agrobacterium에 식물 조직을 감염시켜 유전자 교정을 유도하여 재분화체(약 10% 재분화율)중 T0 식물체(3개체)에서 BoFLC-sg2에 의해 +1bp 삽입 또는 –20bp 결실을 보이는 재분화체 확보하였다. pBAtC::BoVIN3 표적 변이 유도체의 경우 재분화체 유도율이 전체 감염 배양체 중 약 30%정도 높게 성공하였고, 현재 이들 개체를 대상으로 변이정도와 돌연변이 형태 등을 분석중이다. 연구개발성과 < 주관: 유전자교정기술을 적용한 개화수명 연장 페튜니아 육종소재개발 및 품종화 > ○ PhACO3,PhACO4 편집용 타켓 선정 및 sgRNA제작 완료 및 확보 ○ 식물발현벡터 구축 및 |
