| 초록 |
□ 연구개발 목표 및 내용 ○ 최종목표 강원도 자생 도라지발효물을 활용한 면역과민반응에 의한 피부 상태 개선소재 개발 및 건강식품 출시 ○ 전체내용 1. 연구개발 개요 및 목표 (1) 강원도 자생식물을 활용한 건강식품 개발의 필요성 - 강원지역의 산업분포에서 건강식품은 큰 비중을 차지하고 있고 강원도 자생식물을 활용한 다양한 웰니스식품이 개발되고 있음. - 중앙정부 지역전략산업 계획에 따라 강원도는 '천연물바이오소재' 산업을 지역특화산업으로 선정하여 육성하고 있음. - 강원도에서 자생하거나 재배되는 생물자원은 총 3,200여종 중에서 건강기능식품학적 가치가 높은 식물은 80여종임. - 해외에서 자생식물 소재로부터 유용성분을 추출하여 natural herbal medicine 및 natural supplement와 같은 제품들이 다수 개발되어 의약품의 대체 소재로서 사용되고 있음. (2) 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 소재 개발의 필요성 - 아토피 피부염은 가려움증을 특징으로 피부발적, 태선화 및 피부감염 등을 보이는 만성 난치성 염증성 피부질환이며, 피부의 면역과민반응을 특징으로 함. - 아토피 피부염은 원인과 발생기전이 다양하고 호전과 악화를 반복하는 만성 질환으로 장기간의 꾸준한 치료가 필요하며, 재발을 반복하는 질병의 특성상 성인이 된 이후까지 중증화, 난치화 되는 경우도 많음. - 2016년 국민건강보험공단 발표 자료에 따르면 우리나라 2015년 건강보험 적용 인구를 기준으로 전체 아토피 피부염 환자 93만 3,000명 중12세 이하 어린이가 거의 절반에 가까운 48.6%를 차지하며, 국내뿐만 아니라 세계적으로도 전체인구의 10~20%에서 나타나는 질환임. - 현재 아토피피부염의 치료는 증상의 정도에 따라 항히스타민제, 광치료, 면역반응 외용제, 면역억제제 등을 사용하고 있으나, 오랜 기간 비특이적 치료제로 인해 많은 부작용이 나타나, 보다 효과적이고 부작용이 적은 새로운 아토피피부염 치료를 위한 타겟 개발이 필요함. (3) 개발 대상 제품 - 본 연구에서는 강원도에서 재배되는 도라지를 이용하여 면역과민반응완화 효능을 가지는 원료 및 건강식품을 개발하고자 함. - 개발하고자 하는 도라지발효물은 도라지를 추출하여 김치유산균으로 발효과정을 통하여 생산된 제품임. - 안전성과, 면역조절 효능으로 알려진 유산균을 이용한 도라지 발효를 통하여 얻어진 발효도라지 추출물의 in vitro 및 in vivo 실험을 통한 면역조절 메커니즘에 대한 이해를 증가하고 이를 통하여 건강식품 원료 및 제품개발에 대한 연구를 진행함. 2. 연구개발 내용 및 결과 ㈜콤비메드 ⦁ 원료 표준화 및 대량생산공정확립 ⦁ 원료 기준규격 설정 ⦁ 제형 연구 ⦁ 원료 표준화 (산지별, 발효 조건별 등) ⦁ 지표성분 시험분석법 확립 ⦁ 대량생산 시스템 확립 ⦁ 면역과민반응 완화용 제품 개발 ⦁ 원료의 영양성분 및 유해물질분석 ⦁ 원료 기준규격 설정 ⦁ 원료 안정성 확인 ⦁ 건강식품 출시 강원대학교 산학협력단 ⦁ 후보 소재의 in vitro 면역과민반응완화 효능평가 및 작용기전 구명 ⦁ 동물실험을 통한 과민면역반응 완화 효능평가 및 작용기전 구명 ⦁ 후보 소재의 in vitro 면역과민반응완화 효능평가 및 작용기전 구명 ⦁ 후보소재별 면역과민반응 완화 활성 평가: HaCaT 세포주를 이용하여 평가 ⦁ 면역과민반응 완화 작용기전 구명: 후보 소재 및 지표성분에 대한 작용기전 ⦁ 아토피 피부염 유발 동물모델에서 후보소재의 면역과민반응 완화 효능평가 ⦁ 후보소재에 대한 바이오마커 변화관찰 ⦁ 면역과민반응 완화에 대한 동물시험 작용기전 연구 (1) 도라지의 원료표준화 ⦁ 유사종 혼입방지를 위한 유전자분석법 확립 - 유사종 혼입 예방을 위한 종판별 유전자 분석법 확립. - 산지별(강원 영월, 경북 영주, 강원 횡성) 도라지의 원재료 판별 분석 완료 . ⦁ 산지별 지표성분 함량 분석 - 산지별 지표성분 함량분석 분석완료. (3지역: 강원 영월, 경북 영주,강원 횡성) ⦁ 강원도산 도라자의 추출 및 배양성 확인 - 강원도산 도라지의 추출방법 및 배양조건에 대한 표준화 확립. ⦁ 지표성분 선정 및 분석법 밸리데이션 - 지표성분 시험분석법 타당성 검토를 위해, 특이성, 정량한계, 정확성,정밀성 등을 확인. - 공인인증기관의 시험법 밸리데이션 완료. ⦁ 발효시간 및 유산균 접종농도에 따른 지표성분 함량 분석 - 발효시간(0, 5, 10, 15, 35, 50, 80 시간)에 따른 지표성분 함량분석완료. - 유산균 접종 농도(1, 5%)에 따른 지표성분 분석 함량분석 완료. ⦁ 대량생산공정 확립 - 대량생산 시스템 확립. (추출 및 발효 scale up 및 공정개선) ⦁ 원료의 영양성분 및 유해성분 분석 - 원료의 영양성분, 미생물, 중금속, 잔류농약분석 완료. (공인인증기관) ⦁ 원료의 안정성확인 - 대량생산된 발효도라지 추출물의 안정성 조사. (추출물의 열 및 습도안정성을 평가하고자 저장기준 중 지표성분 변화 관찰) ⦁ 기능성원료 기준규격설정 - 성상, 지표성분(자체분석 및 공인인증기관 실시) 함량, 유해물질 함량에 바탕으로 기준규격을 설정함. (2) 발효도라지의 면역과민반응 완화 in vitro 효능검증 ⦁ 발효도라지 추출물의 세포독성평가 - 발효 전/후 도라지 추출물 및 표준화된 발효도라지의 세포독성 평가 결과, 각질형성세포주(HaCaT cell line)에서 200 μg/mL 농도까지 세포독성을 나타내지 않았음. ⦁ 발효도라지 추출물의 과민면역반응 개선 바이오마커 평가 - 아토피 피부염 유발 인자인 Th2 림프구를 유도하는 cytokine(IL-6 및 IL-1β)의 생성량을 평가한 결과 표준화된 발효도라지 추출물을 처리한 군에서 농도 의존적으로 cytokine 생성이 저해됨을 확인하였음. - 아토피 피부염 유발 인자인 Th2 림프구를 염증부위로 이동을 유도하는 chemokine(MDC 및 TARC) 생성량을 평가한 결과 표준화된 발효도라지 추출물을 처리한 군에서 농도 의존적으로 chemokine 생성이 저해됨을 확인하였음. - 면역과민반응을 유도하는 chemokine(MDC 및 TARC)의 생성 기전인 NFκb 및 STAT1의 활성화를 평가한 결과 표준화된 발효도라지 추출물을 처리한 군에서 농도 의존적으로 저해됨을 확인하였음. (3) 발효도라지의 면역과민반응 완화 in vivo 효능검증 ⦁ 조직학적 분석을 통한 발효도라지의 면역과민 반응 개선 평가 - DNCB로 아토피 질환이 유도된 NC/Nga mouse clinical skin severity를 측정한 결과, DNCB를 바른 음성 대조군과 비교하여 발효도라지 및 지표성분인 PD/PE 투여 군에서 농도 유의적으로 감소함. - DNCB처리로 인해 증가된 표피층의 두께 및 비만세포 (mast cell)수는 발효도라지 및 지표성분인 PD/PE 투여 군에서 농도 유의 적으로 감소함. ⦁ 혈액 분석을 통한 발효도라지의 염증성 바이오마커 개선 평가 - DNCB를 바른 음성 대조군과 비교하여 발효도라지 및 지표성분인 PD/PE 투여 군에서 Immunoglobulin E의 혈중 농도가 유의적으로 감소함. ⦁ 등 피부조직 분석을 통한 발효도라지의 염증성 바이오마커 개선 평가 - Th2세포에서 주로 발현되는 사이토카인 (IL-6, IL-31, IL-31R, CCR3)의 mRNA 발현은 발효도라지 및 지표성분인 PD/PE 투여 군에서 농도가 유의적으로 감소함. ⦁ 비장에서 분리한 세포에서의 발효도라지의 염증성 바이오마커 개선평가 - 발효도라지 및 지표성분인 PD/PE 투여 군에서 Th2세포에서 주로 발현되는 사이토카인(IL-4, IL-5, IL-13)의 발현은 감소되었으며, Th2세포에서 주로 발현되는 사이토카인(IFN-γ)의 발현은 증가되었음. ⦁ 면역세포분석을 통한 발효도라지의 염증성 바이오마커 개선 평가 - 림프절, 비장, 등 피부조적 및 혈액 중 PBMC 에서의 아토피 유도세포 표지인자(CD4, CD8, CD23, CD11b, B220, Gr-1, SiglecF)의 양을 측정하였으며, 발효도라지 및 지표성분인 PD/PE 투여 군에서 감소하였음. (4) 제품개발 ⦁ 대량생산 시스템 확립을 통한 개발원료를 활용한 제품 개 |
