| 초록 |
□ 연구 목표 및 내용 ◼ 최종 목표 1. 최근 LHX-1 관련 연구는 신장 및 배아 발달에 있어 apoptosis에 관여하며 당뇨 유발 인자인 것으로 확인됨. 2. 암관련 연구에서는 암 세포에서 LHX-1이 과발현 되어 있지만, 아직까지, ⓵ 암에 대한 LHX-1의 기능, ⓶ LHX-1의 과발현으로 인한 암 발생 및 전이, ⓷암에서의 LHX-1의 Apoptosis 억제 기능 ⓸ 암에 있어 LHX-1 유전자의 기능 및 암 전이 유발 transcription factor와의 상관관계, 암줄기세포 전환과 Apoptosis의 연관성에 대한 연구는 국내외적으로 전무한 상태임. 따라서, 본연구진은 다음과 같은 후속 연구를 제안 하고자 함. ▶ 본 연구진은 유방암에서의 암줄기세포 표적 단백질 선별을 위해 기존의 환자의 정상 및 유방암 조직 microarray 분석을 통해 LHX-1 유전자가 암 줄기세포에서 과발현 되어 있으며, Apoptosis 조절에 있어 그 기능이 전혀 밝혀져 있지 않은 LHX-1 유전자를 선별하였고 예비 결과를 도출 하였음. 본 연구를 기반으로 LHX-1을 이용한 Apoptosis 억제 관련 유전자 조절을 통해 암줄기세포 전환 및 전이를 제어함으로써 암세포 치료 효과 및 암에 의한 통증 치료에 사용할 수 치료 기술을 수립하고자 함. ◼ 전체 내용 ◉ LHX-1에 의한 Apoptosis 억제기능으로 신규 분자표지자 / 표적분자 발굴 플랫폼 구축 • 유방암 세포주를 이용하여 LHX-1 과발현 및 knockdown 세포주를 확립 후 발암, 전이 및 암줄기세포 전환 기전과 Apoptosis 조절 기전 수행함. • LHX-1 유전자와 광센서 유전자를 결합시켜 과발현 세포주 및 LHX-1 knockdown 세포주를 구축하고, 그 cell을 모델 쥐에 주입한 후 전이된 간 및 폐 조직을 적출하고 그 조직의 RNA 및 단백질을 추출하여, RNA sequencing 기법을 통해 여러 가지 타겟 유전자에서 LHX-1 조절 신규 통증 분자표지자 / 표적분자 후보군을 발굴함. ◉ LHX-1에 의한 Apoptosis 억제기능 기반 신규 분자표지자 / 표적분자의 유효성 및 기능성 확인 • 신규 분자표지자 / 표적분자의 기능성 및 유효성을 확인하기 위해 유방암 세포주 및 public database에서의 발현 확인하고 세포내 발현 위치를 검증함 • LHX-1에 의한 Apoptosis 억제기능 기반으로 신규 분자표지자 / 표적분자에 의한 전이 및 암줄기세포 전환 기전을 규명하기 위해 과발현 및 knockdown 세포주를 확립 후 기능성 수행함. ◉ 유방암 세포 모델 및 동물모델을 이용한 LHX-1 기능 연구 • 본 연구에는 HMLE cell을 이용하여 FACS를 통해 cancer stem cell의 특징을 보이는 CD44<sup>high</sup>/CD24<sup>low</sup> cell과 정상세포의 특징을 보이는 CD44<sup>low</sup>/CD24<sup>high</sup> cell을 분리하여 LHX-1 과발현 cell line을 구축하여 LHX-1에 의한 암줄기세포 전환과 Apoptosis의 기전 연구를 수행할 예정임. • HMLE cell의 CD44<sup>high</sup>/CD24<sup>low</sup> phenotype을 보이는 cell을 이용하여 LHX-1 유전자와 광센서 유전자를 결합시켜 과발현 세포주를 구축한 후 쥐에 주입시켜 폐와 간으로 전이능을 조사할 예정임. ◼ 1단계 ❏ 연구 목표 LHX-1와 세포생존 연관성 규명 유방암 전이능 및 세포생존에 있어서 LHX-1 기능 규명 Apoptosis에 대한 LHX-1 유전자 기전 확립 MT와 Apoptosis에 대한 LHX-1 유전자의 기능 규명 LHX-1에 의한 암줄기세포 유도 규명 LHX-1에 의한 apoptosis 조절을 통해 암줄기세포 유도 규명 ❏ 연구 내용 MCF10A cell을 이용한 LHX-1 과발현 세포주 확립 LHX-1 발현으로 인한 cell growth, anokis, MTT, colony formation assay, 분석 LHX-1 과발현 세포주를 이용 PCR array을 통한 EMT 및 Apoptosis 조절 인자 양상 확인을 통한 LHX-1에 의한 apoptosis 유발 인자 조절 기전 도출 인체 유래 normal human mammary epithelial cell (HMLE) cell을 이용한 LHX-1과발현 cell 구축 FACS을 통한 HMLE-LHX-1 cell에서 apoptosis (annexin V/Pi) 분석 LHX-1에 의한 anti-apoptosis 유전자 발현 조절 규명 및 HMLE-LHX-1 cell를 이용한 Apoptosis 억제 기전 규명 HMLE-LHX-1 cell에서 세포 생존과 연관된 signal pathway 조절 및 EMT 유발에 관여하는 Transcription Factor 및 EMT 전환 규명 LHX-1에 의한 Apoptosis 및 EMT 유발 관련 조절 인자간의 연관성 규명 HMLE-LHX-1 cell을 이용한 유방암줄기세포 marker인 CD24<sup>Low</sup>/CD44<sup>High</sup> 발현 분석 HMLE-LHX-1 cell에서 암줄기세포 특성인 암성장, 암 발생 및 전이능 확인 HMLE-LHX-1 cell에서 CD24<sup>Low</sup>/CD44<sup>High</sup> 발현과 Apoptosis 간의 연관성을 FACS 분석을 통해 규명 확립 HMLE-LHX-1 cell에서 apoptosis 조절인자 제어를 통한 전이능 조절 규명 및 암줄기세포 형성 조절 규명 ◼ 2단계 ❏ 연구 목표 LHX-1 발현에 의한 암줄기세포 유도와 Apoptosis 연관성 규명 LHX-1 유전자에 의해 유도되는 줄기세포 및 Apoptosis에 대한 RNA-seq 분석 LHX-1에 의한 apoptosis 억제에 따른 Tumorigenicity와 metastasis 규명 LHX-1에 의한 새로운 Apoptosis 조절 및 항암 내성 극복 효과 규명 ❏ 연구 내용 CD24<sup>Low</sup>/CD44<sup>High</sup> 발현 세포주에 LHX-1 knockdown 세포주 확립 LHX-1 knockdown cell에서 cell growth, anokis, colony formation assay 통한 apoptosis 규명 LHX-1 knockdown cell에서 apopotois와 암줄기세포와의 연관성 규명 RNA sequence 이용하여 LHX-1 유전자에 의한 조절 인자 분석 Bioinfomatic analysis를 통하여 LHX-1에 의해 유도되는 조절 유전자간의 기능 네트워크 모델 확립 LHX-1에 의해 유도되는 새로운 암줄기세포 전환 및 Apoptosis 유전자 조절 인자 확보 LHX-1 knockdown cell을 이용한 동물실험을 통해 암 발생 및 전이 규명 mice survival 및 tumor histology에 있어 LHX-1 역할 분석 동물실험으로부터 회수된 폐를 이용한 Apoptosis-TFs 및 EMT-TFs 조절 분석 LHX-1 knockdown cell에서 새로운 암줄기세포 marker 조절 규명 LHX-1 knockdown cell을 이용한 새로운 Apoptosis 조절인자 제어 기전 규명 ABC transporter 유전자 (세포밖으로 항암제의 배출을 조절하는 인자)의 발현 규명 및 항암제에 의한 저항성 규명 □ 연구성과 본 연구진은 유방암에서의 암줄기세포 표적 단백질 선별을 위해 기존의 환자의 정상 및 유방암 조직 microarray 분석을 통해 LHX-1 유전자가 암 줄기세포에서 과발현 되어 있으며, Apoptosis 조절에 있어 그 기능이 전혀 밝혀져 있지 않은 LHX-1 유전자를 선별하였고 연구를 기반으로 LHX-1을 이용한 Apoptosis 억제 관련 유전자 조절을 통해 암줄기세포 전환 및 전이를 제어함으로써 암세포 치료 효과 및 암에 의한 통증 치료에 사용할 수 치료 기술을 수립하고자 함. LHX-1에 의해 유도되는 EMT 및 Apoptosis 및 전이연구를 통해 LHX-1에 의해 조절되는 새로운 조절 유전자들을 확보를 통해 해당 분야에 대한 차후 연구 및 이해의 폭을 확대시킬 것으로 예상됨. 따라서 위의 |
