| 초록 |
인공번식기술을 이용한 우수가축 생산 및 형질전환 동물의 생산을 위해서는 반드시 체외성숙된 난자의 품질이 뒷받침 되어야 한다. 돼지의 경우 보조생식술에 이용되는 난자의 공급원은 대부분 도축된 미경산돈의 난소로부터 회수되는 난자를 이용하며, 이러한 체외에서 성숙된 난자는 체내에서 성숙된 난자에 비해 낮은 발달능력을 보인다. 따라서 본 연구는 돼지 난자 체외성숙의 새로운 방법을 제시하고 난자의 착상 전 발달능력을 조사하여 상용화 할 수 있는 돼지 체외성숙 시스템을 구축하는데 목표를 두었다. 본 연구에서는 배양액에 첨가되는 NaCl의 함량 조절에 따른 삼투압의 변화를 통해 난자의 세포질 성숙을 유도하는 독창적인 방식을 적용하여 실험을 진행하였다. 일반적으로 난자의 성숙에 이용되는 배양액의 삼투압은 생리적 삼투압과 유사한 280mOsm에서 300mOsm을 이용한다. 하지만 우리 연구는 감소된 NaCl 농도(61.6mM)를 통해 낮아진 삼투압(225mOsm)을 난자의 성숙 배양액에 적용하였다. 우리는 시판되는 배양액인 aMEM 배양액에 저농도 NaCl을 적용하여 단위발생 및 체세포 핵이식을 통해 착상 전 배아 발달능력을 검토하였다. 그 결과 0.1% polyvinyl alcohol(PVA)이 포함된 한정배지 및 10% 돼지 난포액(PFF)이 포함된 배양액에서도 감소된 NaCl을 적용하였을 때 난자의 위란강 크기를 증가시킬 뿐만 아니라 세포질내 glutathione 농도를 증가시켰다. 저염배양액에서 성숙된 난자를 단위발생 및 체세포 핵이식을 통해 배아를 작성하여 배아 발달능력을 조사하였을 때에도 무처리구에 비해 유의적으로 높은 배반포 발달률을 보이는 것으로 조사되었다. 본 연구에서 난자의 품질을 비침습적으로 평가하는 방법으로 고삼투압 배양액에서의 난자 형태변화를 통한 검사법이 고려되었다. 정상적인 난자는 고삼투압 조건에서 세포질이 수축되며 등삼투압 용액으로 복귀시켰을 때 모양이 원상태로 회복된다. 체외에서 성숙된 난자의 경우 원형 또는 불규칙 이 두 가지 수축 패턴이 관찰된다. 원형으로 수축되는 난자는 불규칙한 형태로 수축되는 난자에 비해 높은 배아 발달능력을 보인다고 보고된 바 있다. 본 연구에서 개발된 저염배양액에서 성숙된 난자를 고삼투압 배양액을 통해 수축 패턴을 분석한 결과 둥글게 수축되는 난자의 비율을 증가시켰다. 또한 둥글게 수축되는 난자는 높은 비율의 배반포 발달로 이어지는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 본 연구에서 검토된 glycine 첨가를 통한 삼투압변화 충격 완화 효과는 감소된 삼투압의 배양액에 적용하였을 때는 유익한 결과는 얻을 수 없었다. Glucuronic acid 및 N-Acetyl-D-glucosamine은 하이알루론산을 구성하는 물질로 난자의 체외성숙 및 체외수정 후 다정자 수정 억제에 필수적인 물질로 알려져 있다. 본 연구에서는 두 물질을 난자의 체외성숙 과정에 적용하여 적정 농도 및 첨가 시간에 대한 검토, 단위발생 및 체세포 핵이식 후 배아 발달능력을 검토하였다. 그 결과 각각 0.05mM의 Glucuronic acid 및 N-Acetyl-D-glucosamine을 체외성숙 배양 초기 22시간에 첨가하였을 때 배아의 발달능력을 향상시키는 것으로 나타났으며 두 물질을 동일한 농도로 병행 처리하였을 때에도 높은 배아 발달 능력을 보이는 것으로 확인되었다. 그 원인을 분석하기 위해 난자의 표립과층반응을 조사한 결과 두 물질이 첨가된 배양액에서 성숙된 난자는 성숙 직후 및 단위발생 후 8시간 후에 더욱 활성화됨을 알 수 있었다. 본 연구과제의 결과를 종합하여 볼 때 시판되는 배양액에서의 저농도 NaCl을 적용한 돼지 난자의 체외 성숙시스템은 난자의 위란강 크기를 증가 및 세포질 내 glutathione의 농도를 증가시켰으며 단위발생 및 체세포 핵이식 이후에 배아 발달 능력을 향상시켰다. 뿐만 아니라, 고삼투압 배양액에서의 수축패턴을 검사하였을 때 둥글게 수축되는 난자의 비율을 증가시켰다. 또한 체외성숙 배양액에 Glucuronic acid와 N-Acetyl-D-glucosamine의 첨가는 난자의 표립과층반응을 활성화하며 배아 발달 능력을 증가시켰다. 이 연구결과를 바탕으로 한 새로운 돼지 체외성숙시스템을 적용하면 고품질의 난자를 생산할 뿐만 아니라 보조생식술의 효율을 증가시킬 수 있을 것으로 사료된다. (출처 : 연구결과 요약문 3p) |
