| 초록 |
□ 연구의 목적 및 내용 뇌세포 분화 및 변이에 따른 뇌종양 발병기전 연구 및 신약개발 연구에 적용되는 기반 연구수단인 중대형 동물모델을 개발하고자, 효율적인 유전자 재조합 기술을 통해 astrocyte specific 한 GFAP 프로모터 및 종양유발유전자(EGFRvIII, HrasV12) 도입 세포주를 확립하고, 체세포핵이식(SCNT) 기법을 적용한 뇌종양 질환모델 돼지를 생산하고자 함. □ 연구결과 1) 고효율 유전자 재조합 기술 개발 및 뇌종양유발 유전자 삽입 세포주 확립 ① 계대배양에 따라 비정상적인 핵형을 보이는 iPS세포는 공여세포 후보에서 제외하고, 동물모델로 적합한 유카탄 미니돼지로 품종선발하고 태아세포주를 수립하였음. ② 뇌종양 유발 유전자(EGFRvIII and HrasV12)를 선발하고, 뇌종양유발시스템(LCMV- LoxP EGFP-Stop LoxP -EGFRvIII-P2A-SV40LT-T2A-DsRed)을 구축하여 그 기능을 확인하였음. ③ 성상세포 특이적인 pGFAP-CreER-LoxP(pcDH-pigGFAP-CreER T2 -puro) inducible 벡터시스템을 gene cloning 기법으로 구축 완료하였음. ④ 구축된 시스템을 Cloud male #5 세포주에 각각 electroporation 기법과 lentiviral vector system으로 도입하여 PCR을 통해 유전체 도입 여부를 확인하였음. ⑤ 형질전환세포주에 도입된 Vector system을 Tamoxifen을 통해 활성화 시킨 후, immuno staining, tumor sphere assay를 통해 종양줄기세포 형성 능력을 확인하였음. 2) 전능성 제어기술 개발을 통한 체세포의 불완전한 역분화 개선 ① 돼지난자의 체외성숙과정에 항산화제인 아연(Zinc)을 첨가하여 수여세포질의 질과 배아발달율을 향상시켰음. ② 배반포의 질에 따른 부착율을 분석하기 위해 배반포를 3단계(Early, Expanding, Hatched)로 나누어서 배양보조세포(MEF) 위에 올려주었음. expanding과 hatched 배반포가 early에 비해 높은 부착율을 보였음. ③ IVF, PA, iPS-SCNT배반포유래 배아줄기세포를 수립하였음. 3) SCNT 전능세포에서의 착상기전 분석을 통한 안정적 전능성 확보 ① 난모세포의 체외성숙에 있어 난구세포와 공배양을 통해 In vivo와 유사한 환경을 만들어 줌으로써 효율적으로 형질전환 동물을 생산을 위한 체외성숙 시스템을 확립하였음. ② SCNT를 통해 생산한 SV40LT 형질전환 배아의 정상성 및 효율성을 IVC를 통해 평가하였음. 그 결과 삽입유전자를 추후 유도할 수 있도록 inducible system내로 삽입하기로 하였음. ③ 총 3개의 형질전환세포주를 확립하였고, SCNT후 배아발달평가를 통해 최적의 세포주를 선발하였음. ④ 난소, 자궁내막, 태반, 탈락막 등 많은 종류의 조직에 존재한다고 알려진 hrG-CSF를 체외성숙과정에 첨가하여 배아발달율을 향상시켰음. 4) 안정적 전능성 확보를 통한 뇌종양 질환모델 돼지 생산 ① 개선된 IVM시스템으로 성숙시킨 양질의 돼지난자로 SCNT복제배아를 생산하였고, 대리모에 이식하였음. ② 뇌종양 질환모델연구를 위한 성상세포 특이적인 pGFAP-CreER T2 inducible 형질전환복제 돼지 생산하였음. ③ GFAP가 발현되는 뇌에서 CreER T2 가 강하게 발현되는 것을 PCR을 통해 확인하였음. 또한 면역염색기법을 통해 뇌조직에서 CreER T2 및 EGFP의 발현을 확인하였음. ④ 대뇌와 소뇌에서 genomic DNA를 isolation 하여 semi-nested PCR 기법으로 확인한 결과, 4OH-TM을 처리한 TG돼지에서 Cre/loxP재조합이 일어나는 것을 확인하였음. □ 연구결과의 활용계획 1) 신경특이적 pGFAP-CreERT2 inducible system도입된 세포주는 추후 신경계질환(알츠하이머,헌팅턴질환 등)모델생산에도 유용한 시스템으로 이용될 수 있음. 2) 돼지를 이용한 뇌종양질환모델은 신약개발이나 발병기전 연구에 있어 기존의 뇌종양 마우스 모델의 한계를 극복할 수 있는 유용한 모델임. 3) 최근 연구동향에 따른 뇌종양 하위유형 별 신경종양 미니돼지모델을 생산을 통해 항암제 저항성 재발 모델 생산 및 검증 시스템 구축을 위한 후속연구를 진행할 예정임. ( 출처 : 요약문 4p ) |
