| 초록 |
2,3-부탄디올은 합성고무를 비롯한 다양한 산업소재의 원료로 활용할 수 있는 대표적인 플랫폼 바이오화학 소재이다. Klebsiella속 미생물의 2,3-부탄디올 합성 대사를 응용한 산업균주 개발 연구가 전 세계적으로 활발하게 이루어지고 있지만, Klebsiella속 미생물은 병원성이기 때문에 상용화에 제약이 따름. 대안으로 안전한 GRAS급 미생물인 Bacillus속의 2,3-부탄디올 합성 대사가 주목을 받고 있지만, 국내에서는 아직까지 관련 연구가 전무한 실정이다. 특히 Bacillus속 미생물의 섬유질 분해 및 고온증식 능력은 풍부한 섬유질 바이오매스를 활용한 2,3-부탄디올 생산 생물공정 개발에 매우 효과적일 것으로 기대됨. 이에 본 연구에서는 Bacillus속 미생물의 2,3-부탄디올 생합성 대사를 이해하고, 산업균주 및 공정 개발을 위한 기반 연구를 수행하였다. Bacillus sp. BRC1의 유전체 분석을 통해 346 아미노산으로 구성된 2,3-부탄디올 합성효소(Bdh)를 분리하였으며, 아미노산 서열을 자세히 분석한 결과, 조효소 NAD(P) 결합부위인 GxxxGxG 서열과 Phe138 and Leu141, 서열이 보존되어 있는 것으로 나타났으며, 전형적인 zinc-containing motif (G-H-E-x- {EL }-G- {AP }-x(4)-[GA]-x(2)-[IVSAC])와 GroES-like domain.을 함유하고 있어, BRC1 2,3-부탄디올 합성효소는 medium-chain dehydrogenase/reductase (MDR) family인 것으로 나타났다. E. coli strain에서 재조합 단백질의 발현을 SDS-PAGE로 분석한 결과, 38 kDa 사이즈의 밴드를 확인하여 bdh유전자의 발현을 확인하였으며, 정제한 bdh 효소는 acetoin과 diacetyl 기질을 모두 D-2,3-BD로 환원시키는 활성을 보였으며, D-2,3-BD의 산화반응활성은 pH 9.0, 50 , Acetoin의 환원반응활성은 pH 6.0, 50℃에서 최적 효소 활성을 보이는 것으로 나타났다. 또한 D-2,3-BD 산화반응과 acetoin 환원반 응의 Km과 Vmax는 각각 6.005 mM, 6.806 mm/min과 0.121 mM, 3.969 mm/min이었다. D-type의 2,3-부탄디올 합성 대사의 중간 산물을 공유하여 경쟁대사에 있는 ldhA 합성 유전자와 meso-type, L-type 2,3-BD 합성 유전자를 제거한 Klebsiella 속 변이균주에 Bacillus sp. BRC1 유래의 D-type 2,3-부탄디올 합성 유전자를 고발현시킨 후 2,3-부탄디올의 생산 여부를 분석한 결과, 12h 째에 1.42 g/L의 2,3-부탄디올을 생산하였으며 컨트롤 균주 (haboring pBR322 벡터)와 비교하여 볼 때 이 2, 3-부탄디올의 isomer는 D-(-) type 임을 알 수 있었다. bdh유전자를 발현한 Bacillus sp. BRC1 재조합 균주(harboring pWH-bdh)를 제작하여, Bdh 효소활성을 측정한 결과 대조구에 비해 약 3배 정도 높은 효소 활성을 보였으며, Bdh 효소활성과 마찬가지로 2,3-부탄디올의 생산량도 대조구와 비교해 13.9% 증가하는 것으로 나타났다. 한편, 이눌린 분해효소 유전자(sacC )를 발현한 Bacillus sp. BRC1 재조합 균주를 제작하여, 이눌린을 함유하는 배지에서 배양한 결과, 배양 45h에 최대인 757.U/mg의 SacC 효소 활성을 보였으며, 대조균주에 비해 약 2.2배 높은 것으로 나타났다(344.3 U/mg). 효소 활성의 증가와 비례하여 2,3-부탄디올의 생성량 또한 3.98 g/L에서 8.1 g/L로 증가하였으며, 생산수율은 이론적 최대값의 81% 수준이었다. 5-리터 바이오리액터에서 fed-batch fermentation을 실시한 결과, 재조합균주에 의한 이눌린으로부터 2,3-부탄디올의 최대 생산량과 생산성은 각각 28.6 g/L, 0.46 g/Lh이었으며, 대사 부산물로 아세토인, 숙신산, 젖산, 아세트산이 각각 0.6 g/L, 1.3 g/L, 2.2 g/L, 1.7 g/L가 생성되어 2,3-부탄디올의 전환수율은 이론적 최대치의 92.3%인 것으로 확인되었다. 본 연구결과는 Bacillus속 미생물을 활용한 2,3-부탄디올 생산 기술 개발을 위한 유용한 기초자료를 제공할 것으로 기대된다. (출처 : Ⅰ. 연구결과 요약문 3P) |
