| 초록 |
연구의 목적 및 내용 • 최종 및 1단계 연구 목표 본 과제 “구조기반 MMO 재설계 기술 개발”은 수용성 메탄 모노옥시게나아제의 촉매적/화학적 성질을 이용하여 메탄의 산화 결과물인 메탄올을 얻어내는 효과적이고 실용적인 원천 기술과 기초기술을 연구하고, 이를 응용하여 실용화에 이바지하는 기술을 제공하는 것을 최종목표로 함. 메탄의 산화물인 메탄올은 바이오 에너지와 대기 중의 온실가스 저감이라는 기대효과로 많은 연구가 이루어졌음에도 효소 기작은 아직도 정확히 밝혀지지 않은 학문적 난재를 내재함. • 1단계 연구 연구 목표 및 내용 제 1단계 연구목표: 활성 부위의 반응중간체를 파악하여 신규 효소 2종 디자인 및 400nmol·min-1mg-1 효소 활성 창출을 1단계 목표로 함. 메탄의 전환과 관련된 수용성 메탄전환 균주의 효소기작은 Methylococcus capsulatus Bath(M. capsulatus)와 Methylosinus trichosporium OB3b (M. trichosporium)를 중심으로 지난 25년간 활발히 연구되어 왔으나, 다양한 단백질들의 결합으로 이루어지는 생물화학 반응의 정확한 기작은 아직까지 밝혀지지 않음. 본 연구과제는 현재 밝혀지지 않은 복합단백질, 즉 조효소와 환원효소가 산화효소와 결합하여 이루어내는 반응에 대한 기작을 이해하여 이를 단백질 공학적으로 응용하려는 일련의 과정을 연구과제 제1~2 단계의 주요 연구내용으로 결정함. 초기 연구과정에서는 효소 활성 부위의 구조적/기능적 특성을 파악하여, 기질의 선택적 산화를 일으키는 화학적/생물학적 기작을 설명하려 함. 도출된 연구 결과를 바탕으로 활성부위를 합성수준이 아닌 단백질 수준에서 구조적으로 모방하여 기존의 메탄 모노옥시게나아제가 갖는 효소 활성을 고온 또는 고압이 아닌 상업적 이용이 용이한 조건에서 촉매적으로 이용할 수 있는 실용화에 연구방향의 초점을 맞춤. 연구개발성과 본 연구과제는, 1차 및 2차년도 연구를 통하여 sMMO 관련 연구과제에 이용할 균주(Methylosinus sporium 5)를 선택하여, 성공적으로 발현 정제를 완료함. 조효소 및 환원 효소는 이종균주 (Methylocystis species M)로 확대를 통하여 이에 따른 활성을 평가하였고, 1단계 목표인 400 mU/mg을 선회하는 561 mU/mg 의 효소 활성 목표 창출하고 관련 중간체 고정 기술 확립을 목표대비 달성하였음. • 최적 활성화 조건에 대한 분석을 통하여 3차 년도에는 신규 산화효소의 구조 파악 완료 및 중합체 구조에 대한 분석이 진행 중이며, 중합체 결합에 대한 H-B-R 중합체의 결합원리를 파악하였음.HDX를 이용한 실험으로 MMOH-MMOB-MMOR이 활성부위에 대해 상호 경쟁을 이루고 있음을 확인함. 이는 효소 활성에 대한 연구로 이루어지며, 보조효소들의 당량에 대한 연구를 진행하였고, Ms. sporium 5 균주에 교차반응을 위한 Methylocystis sp. M을 적용하여 최적 활성을 이루어냄. • 효소구조 연구를 통한 메커니즘 규명의 일환으로 Ms. sporium 5로부터 MMOH 구조를 확보하였으며, MMOH-MMOD 구조를 화학적 상호결합 설명이 가능한 분해능으로 확보하였음. 산화효소의 구조 파악 및 MMOH-MMOR 의 초저온 전자현미경 (Cryo-EM)을 이용한 구조 정보 확보를 위한 노력으로 전자 전달경로 파악에 대한 연구토대를 마련함. • 신규효소의 제안을 위한 four-helix bundle의 디자인으로 신규 플라스미드의 구축을 완료 하였음. 수용성 조건에서의 원만한 발현을 위하여 다양한 조건에서의 발현 시도와, 이종균주를 통한 최적 활성 확보를 완료하였음. sMMO의 매우 낮은 기질 선택성을 이용하여 다양한 기질 (알칸, 알킨, 염소화합물, 벤젠)등의 산화를 확인하였음. • 반응 중간체 확보를 통한 중간체 확보를 통하여 MMOH 이철이온에 대한 정보를 확인하였으며, MMOR의 전자 전달 경로에 대한 효과적인 설명을 이루어냄. NADH로부터 전달되는 전자의 전달이 FAD 및 ferredoxine 도메인을 이용하여 전달되는 속도를 파악함. 연구개발성과의 활용계획(기대효과) 1단계 연구를 통하여 선진국 중심으로 이루어지던 난해한 효소인 sMMO에 대한 발현 및 정제를 이루어냈으며, 활성 증진을 목표로 이종 균주의 적용을 이루어냄. 다양한 기질의 특이성에 대한 연구결과와 산도에 따른 활성도의 영향 및 관련 효소의 적용에 대한 체계적인 접근으로 지속적인 효소 활성을 이루어 낼 것으로 기대함. 제한된 균주에서 연구된 sMMO의 관련 연구는 새롭게 제시된 균주의 적용이라는 관점에서 중요한 활성증대 정보를 제공할 것으로 사료되며, 산화 효소의 구조적 특성과 산화-저해 효소 중합체의 구조는 2단계에서 이루어질 효소 부위 활성의 묘사라는 측면에서 중요한 정보를 제공할 것으로 사료됨. 1단계 획득 관련 기술과 단백질 구조 활용 정보를 이용하여 2단계 연구 성과 창출에 더 큰 목표를 이룰 수 있을 것으로 기대함. (출처 : 요약문 4p) |
