| 초록 |
연구개요 ● X-선 결정학과 cryo-EM을 이용한 atypical GPCR인 CXCR7의 beta-arrestin에 의한 탈감각 기전연구 연구 목표대비 연구결과 ● 본 연구의 목표는 CXCR7, CXCR4, 탈감각 관련 단백질들의 다양한 construct 클로닝, 발현조건 및 안정성 확립 및 large scale 발현조건을 확립하고, large-scale 발현 및 정제 조건 및 결정화 조건을 확립하며, 이를 통한 삼차원 구조를 규명하는 것임. ● CXCR7 C-terminal phosphopeptide와의 결합 패턴을 분석함. HEK293 cell을 이용하여 CXCR7 단백질을 순수한 형태로 정제하고, 질량분석을 통해서 C-terminal phosphorylation pattern을 분석함. 이를 톹해 CXCL12에 의해 set1과 set2 위치에 인산화가 유도됨을 밝힘. ● 다양한 형태의 beta arrestin2 단백질을 만들어 정제하고, CXCR7의 C-말단에 존재하는 두 개의 phosphorylation pattern을 포함하는 set1, set2 펩타이드를 합성하여 각각 beta-arrestin2와 결합체의 삼차원 구조를 규명함. ● 이를 통해 CXCR7의 set1과 set2가 각각 Beta arrestin2와 어떻게 결합하고, peptide binding이 어떻게 beta arrestin2의 구조를 변화시키는지에 대해서 다양한 생화학, 생물리화학, 세포생물학적 방법으로 규명함. ● Set1의 경우에 N-도메인에 결합하여, interdomain rotation을 약 8도정도 돌리는 구조를 만든다는 사실을 밝혔음. 또한 set2의 경우에는 Beta arrestin2 WT의 inactive form에 결합한 구조를 밝혀서, intermediate state에 해당하는 구조를 밝힘. 이를 통해서 GPCR phosphopeptide가 어떻게 beta arrestin2에 결합하고, 일련의 구조변화를 일으키는지에 대해서 기작을 밝힘. 또한 HDX-MS를 이용하여, Set1 결합에 따른 Beta arrestin2의 구조 변화를 분석함. ● Set1 펩타이드와의 결합체의 구조 및 분석 결과는 Structure 논문에 게재하였고, set2와의 결합체의 구조는 논문 준비 중임. ● CXCR7 full length 단백질은 pEG-BacMam system으로 클로닝하여 HEK293S cell에 삽입하였고, lysozyme이 N-term과 ICL에 삽입된 형태로 각각 vector를 확보하고 발현 및 정제에 성공함. 연구개발성과의 활용 계획 및 기대효과 (연구개발결과의 중요성) ● 현재까지 GPCR과 Beta arrestin1과의 결합체의 cryo-EM 구조는 여러 개가 밝혀져서 분자적 기전을 이해하고 있지만, 아직 Beta arrestin2와의 결합체의 구조는 밝혀져 있지 않으므로 구조 규명 자체 만으로도 학술적인 가치가 크다고 할 수 있음. ● 기존의 GPCR 기반 신약 개발 연구는 균형적인 signaling에 관여하는 agonist 또는 antagonist를 중심으로 진행되고 있으나, 본 연구를 통해 Beta-arrestin biased 탈감각 기작만을 유도하는 신약 후보 물질을 발굴 및 제안 할 수 있음. ● CXCR7/Beta-arrestin2 탈감각 기전을 통해 암세포의 전이에 관여하는 CXCR4/CXCL12를 조절할 수 있기 때문에 이에 대한 분자적 이해를 바탕으로 새로운 항암 후보 물질을 발굴에 응용될 수 있음. (출처 : 요약문 2p) |
