| 초록 |
1. 연구개발의 목적 악성 종양의 증식은 'Warburg 효과'라고 알려진 aerobic glycolysis에 의존적이라고 알려져 있음. 암 전이 과정에서 암 세포는 극심한 metabolic stress하에 놓이고, 이를 극복한 일부의 암세포가 전이를 일이키는 것으로 알려져 있지만 암 세포 대사과정에서 이화작용 (catabolic process)에 대한 연구는 많지 많음. EMT는 암세포의 재발과 전이의 생물학적 기전으로 암세포의 dormancy 및 apoptosis에 대한 저항성 획득 기전을 제시해 주고 있으며, Snail 발현 조절이 EMT에서 중심적인 역학을 담당함. 본 연구는 EMT 과정에서 암세포의 생존 능력을 증가시키는 및 이화작용 조절 기전을 밝히기 위해 (1) Snail에 의한 역동적인 당대사 조절을 규명하고, (2) EMT 과정에서의 pentose phosphate pathway의 역할, (3) Snail/EMT axis에 의한 FAO catabolism 조절 기전을 규명하고자 함. 나아가 암세포 생존의 이화작용 조절 및 대사 조절기전을 바탕으로 새로운 치료 표적 및 전략을 제시하고자 함 2. 연구방법 본 연구는 Snail/EMT axis에 의한 당대사 조절 연구를 수행하기 위하여 (1) Snail knock down(KD) 세포 및 Snail 과발현 세포를 제작하고 각각 lactate level 및 세포 증식 분석, PFKP 및 G6PD 발현 분석 (2) PFKP KD 세포주 제작 및 Snail KD 세포주와 PFKP KD 세포주에서 metabolomic analysis (3) Snail 과발현 및 KD 암세포에서 cell death, ROS 변화 및 NADP/NADPH ratio 분석 (4) Snail에 의한 PFKP 타겟 부위 분석 (5) Snail 및 glycolysis 효소조절에 의한 in vivo 암 전이 조절 분석을 수행하였음. Snail/EMT axis에 의한 지방대사 조절 연구를 수행하기 위하여 (6) Glc starvation 조건하에서 Snail 조절에 따른 ATP 증감 수준, CPT1 및 FAO 관여 효소의 활성 분석 및 lipid 축적 분석 (7) ACC2 Promoter에 E-box 분석 및 Snail 조절에 의한 ACC2 reporter activity 및 단백질 발현 분석 (8) Snail/ACC2 조절에 ATP 증감 및 NADPH 조절 분석 (9) ACC2 조절에 의한 암세포 생존능 분석 및 항암제 내성분석 (10) PPP 및 FAO 조절제에 의한 항암제 내성 조절 분석을 수행하였음. 3. 연구 결과 (1) Snail에 의해 glycolysis의 최종 산물인 lactate 발현이 감소하고 세포의 증식은 감소함. Snail에 의해 glycolysis 과정의 비가역적 효소인 PFKP의 단백질 발현은 감소되고 G6PD 단백질 발현은 유지되었음. 이를 통해 Snail/EMT axis에 의해 증식모드가 정지되고 당대사는 glycolysis에서 PPP로 재편성됨을 알 수 있었음. (2) Snail KD 세포주와 PFKP KD 세포주는 정반대의 metabolomic analysis 결과를 보였음. (3) Snail에 의해 cell death 및 ROS가 감소하고 NADPH가 증가함. 이를 통해 암세포는 Snail 에 의한 PPP로의 당대사 재편성을 통해 NADPH를 얻고 생존에 필요한 환원력을 획득함을 알 수 있었음. (4) PFKP의 proximal promoter 내 Snail이 결합할 수 있는 E-box(CACCTG) 위치를 분석하고, mutants를 제작한 후 mutated PFKP promoter의 reporter activity 실험을 통해 PFKP의 E-box sites, -305, -340, -409는 각각 Snail과 결합하는 부위이며, PFKP는 Snail의 downstream target임을 확인함. (5) MDA-MB-231-D3H2LN 세포주를 이용하여 누드마우스 in vivo 암 전이 동물모델 구축하고 이를 이용하여 Snail KD 상태에서 shPFKP 유도 시 lung metastatic foci가 증가하고, Snail 과발현 유도 상태에서 PFKP를 과발현시키면 lung metastatic foci가 감소함을 확인하여, Snail/PFKP axis에 의한 암세포 생존모드의 조절이 기능적임을 확인함. (6) Glucose starvation된다 하더라도 Snail이 과발현되면 glucose가 풍부한 상태에서의 세포 수준으로 ATP level이 유지될 수 있고, 이 때 long-chain fatty acids가 mitochondria 내로 들어갈 때 gate-keeper enzymes 역할을 하는 CPT1의 활성도 증가함. 상대적으로 세포 내 lipid 축적은 감소함. 이를 통해 Snail/EMT axis에 의해 지방대사는 FAS가 정지되고 FAO 방향으로 재 편성됨을 알 수 있었음. (7) CPT1의 활성을 조절하는 ACC2 효소의 promoter에서 E-box 위치를 분석하고, mutants를 제작한 후 mutated ACC2 promoter의 reporter activity 실험을 통해 ACC2의 E-box sites, -744가 Snail과 결합하는 부위이며, ACC2는 Snail의 downstream target임을 확인함. (8) Glucose starvation 조건 하에서 Snail에 의해 ATP와 NADPH 수준이 증가하나, 여기에다 ACC2를 유도하면 다시 ATP 및 NADPH가 감소함. 이를 통해 Snail/ACC2 axis에 의해 암세포 생존을 위한 에너지 및 환원력이 조절됨을 확인함. (9) ACC2가 억제 조절되면 암세포의 생존능이 증가하고 항암제 내성이 증가하였음. (10) PPP 및 FAO 조절제에 의해 암세포의 생존능이 감소되었음. 이는 대사조절제를 항암제 내성 조절에 효과적으로 사용될 수 있음을 시사함. (11) Niclosamide는 기생충약으로 촌충(tapeworm)의 glucose uptake, oxidative phosphorylation, 및 anaerobic metabolism을 억제하는 것으로 알려져 있음. 본 연구에서 Niclosamide의 약물타겟이 Axin-GSK3 결합 부위이며, 항-RAS 효능이 있음을 밝혀, Niclosamide를 항암 목적으로 사용할 drug repositioning의 근거를 마련함. 또한 가족성 용종증(FAP, Familial Adenomatous Polyposis) 환자와 동일한 유전적 배경을 가진 APC-MIN mice 모델에서 니클로사미드가 우수한 약물 효능을 보임을 밝힘. 4. 기대효과 (1) 암전이 기전과 암세포 에너지 대사 조절을 통한 새로운 치료전략 제시 (2) 기존의 식약청 허가된 대사조절 약제를 “리포지셔닝”하므로서 임상 중개 (clinical translation)를 가속화 (3) 신약개발비용 절감 및 암관련 사회적 비용 감소 (4) 새로운 암관련 연구분야 및 항암제 시장 개척의 선도적 위치 선점 (출처 : 연구개발사업 최종연구개발결과보고서 요약문 4p) |
