| 초록 |
연구개발 목표 및 내용 최종 목표 유전체 교정 기술을 이용하여 바이러스, 진균병 저항성 작물 (토마토, 콩, 밀, 옥수수)과 내건성 벼를 개발하고자 함 전체 내용 ○ 제1주관과제 : 유전체교정 기술과 디코이 엔지니어링을 이용한 바이러스 병저항성 토마토 품종 개발 - 토마토에는 PBS1 (SlPBS1)이 존재하며 AvrPphB는 SlPBS1을 절단시킴 - AvrPphB는 토마토에서 세포사멸을 유도하고 저항성 반응을 유도하여 박테리아의 생장이 억제됨 - SlPBS1PVY가 PVY protease에 의해 절단이 일어나며 SlPBS1TEV가 TEV protease에 의해 절단이 일어남 - 병원균 protease에 의한 engineered PBS1의 절단은 세포 사멸을 유도함 - SlPBS1은 palmitoylation motif를 이용해 세포막에 위치함 - SlPBS1SEMPH를 AtRPS5, AvrPphB와 함께 발현시키면 세포사멸 반응이 유도됨 - AtRPS5는 SlPBS1 또는 SlPBS1SEMPH와 결합하는 것을 Co-IP를 통해 증명함 - SpCas9-SlPBS1 gRNA를 토마토에 형질전환하여 35개의 GE0 line 선별 - Next generation sequencing을 이용해 precision editing의 여부 탐색 - DC3000 (AvrPphB) 접종시 야생종인 M82에서 관찰되었던 세포사멸 반응이 slpbs1-1, slpbls1-2 돌연변이체에서는 사라짐 - 상동성 재조합 (HR)을 이용하여 SlPBS1의 AvrPphB 절단부위를 TEV 또는 PVY protease 절단부위로 치환하기 위해 기Cpf1/SlPBS1-donor template construct 제작 및 agrobacterium을 이용한 형질전환 ○ 제1협동과제 : CRISPR/Cas9 기술을 이용한 내건성 벼 계통 육성 - CRISPR/Cas9 기술을 이용한 U-box type E3 ubiquitin ligase 유전자 편집계통을 육성함 - OsPUB 유전자(U-box type E3 ubiquitin ligase gene family)의 target 영역을 검토하고 특이적 sgRNA를 선정하여 벡터를 제작함 - CRISPR/Cas system 이용 타켓 유전자의 gene editing 벡터를 구축하고 식물발현 벡터를 이용하여 promoter 활성을 검정함 - sgRNA::Cas9 도입 Ti-plasmid 벡터를 구축하고 Agrobacterium-mediated 형질전환 방법을 이용한 형질전환체(벼)를 육성함 - NGS 분석에 의한 유전자 변이 유형을 분석하고 single copy 도입 편집개체를 선발함 - 유전자 편집 개체에 건조 스트레스 처리를 실시하여 선발조건에 대한 기초 데이터를 확립하며 건조 스트레스 처리 RNA-sequencing 분석을 통한 OsPUB 유전자를 대상으로 전사체 분석을 실시함 - 건조 저항성이 증진된 null 계통을 대상으로 하여 qRT-PCR을 적용하여 OsPUB 유전자의 스트레스 조건하에서의 발현 분석을 실시하고 주요 생리, 생화학적 분석을 수행함 - 내건성 OsPUB 유전자 편집 계통의 세대 고정을 실시하고 주요 농업 형질 조사를 실시함 ○ 제2협동과제 : CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 콩의 진균병과 난균류병 저항성 소재 개발 - 효과적인 CRISPR-Cas9 plasmid 제작법으로 다수의 유전자 타깃 plasmid 제작 - Willams82콩과 대원콩의 CRISPR-Cas9-Agrobacterium-mediated transformation 시스템으로 제초제 저항성 및 유전자 편집된 콩 형질전환 제작 - 콩 잎에 CRISPR-Cas9-Agrobacterium-mediated transient transformation 시스템 개발 - 콩의 병저항성 검정법 시스템 확립 - 콩의 병저항성관련 WRKY전사인자, NPR조절인자의 sequence와 계통분류학적 분석 - 콩의 병저항성관련 유전자의 발현량 확인 - 콩의 GmNPR3조절인자의 병저항성관련 기능 확인 - CRISPR-Cas9 plasmid 기반과 RNP-mediated CRISPR-Cas9 시스템의 콩원형질체 도입 및 재분화 ○ 제3협동과제 : 붉은곰팡이병 저항성 신육종기술 실용화 소재 개발 - 붉은곰팡이 전사조절인자 대상을 선발하고 유전적 복원을 통해 형질을 확정한다. - in vitro RNA간섭 선발시스템을 구축한다. - HIGS 타깃 후보 유전자에 대한 가치제고화를 위한 오믹스(omics)기반의 기능유전학 연구를 수행한다. - 타깃 유전자 in vitro RNA간섭 선발을 통해 유전자억제 효과를 검증한다. - in planta RNA간섭 선발시스템을 구축한다. 연구개발성과 (1) 정성적 연구개발성과 < 제1주관과제 > ○ 토마토 PBS1의 기능 및 면역반응 유도 탐색 - SlPBS1은 palmitoylation motif(C3/C6)를 이용해 세포막에 위치 - SlPBS1의 N-term.은 세포막에 위치하지만 C-term.은 핵과 세포질에 위치함 - 토마토 SlPBS1의 ‘STKPQ’를 ‘SEMPH’로 치환하면 RPS5의 활성화가 일어나고 세포사멸이 일어남 - AtRPS5가 AtPBS1, SlPBS1, SlPBS1SEMPH와 단백질 상호작용함 ○ Engineered PBS1의 작동 시스템 구축 - SlPBS1의 AvrPphB의 절단부위를 viral protease의 절단부위로 치환시킨 engineered SlPBS1PVY와 SlPBS1TEV construct 제작 - Engineered PBS1 (SlPBS1PVY, ,SlPBS1TEV)이 PVY protease와 TEV protease에 의해 절단이 일어남 - Viral protease에 의한 engineered PBS1 (SlPBS1PVY, SlPBS1TEV)의 절단은 토마토에 세포사멸 반응을 유도함 ○ CRISPR/Cas9를 이용한 PBS1 mutant 토마토 제작 - SpCas9-SlPBS1 gRNA construct 제작 및 토마토 형질전환 - SlPBS1 CRISPR alleles (slpbs1-1, slpbls1-2) 확보 - slpbs1-1, slpbls1-2에서 세포사멸 반응 실험을 한 결과, 저항성 단백질의 인식작용이 사라짐을 확인 ○ Next generation sequencing을 이용해 precision editing의 여부 탐색 - PCR, Sanger sequencing, Deep sequencing, ICE analysis를 이용하여 SlPBS1 부위에서 editing이 일어난 두 개의 SlPBS1 CRISPR alleles 확보 ○ 상동성 재조합 (HR) 기반 CRISPR-Cas9/Cpf1 유전자 교정 시스템 구축 - Cpf1-SlPBS1 gRNA-donor template construct 제작 - Agrobacterium을 이용해 Cpf1-SlPBS1 gRNA-donor template construct를 M82 wild-type 토마토에 형질전환 시킴 < 제1협동과제 > ○ OsPUB 유전자들의 U-box type E3 ubiquitin ligase 관련 유전자의 sgRNA 디자인 및 합성 ○ CRISPR/Cas9 함유 벡터 구축 및 Agrobacterium-mediated 방법을 이용한 형질전환체 육성 ○ NGS에 의한 유전자 편집개체의 변이 유형 분석 및 single copy 도입 Null 개체 선발 (T0) ○ 건조 및 도열병 감염 조건에서 OsPUB 유전자의 transcriptome 분석을 통한 스트레스 처리하의 유전자 발현 분석 및 유전자 promoter 부위의 cis-acting regulatory elements 분석을 통한 스트레스 연관성 확인 ○ 건조 및 염 조건에서 유전자편집 null 계통벼의 저항성 검정 및 발현 분석을 통한 내건성 검정 및 계통 선발 ○ T1 식물체 육성 및 null 개체 선발 및 T2~T3 종자 수확 < 제2협동과제 > ○ 효과적인 CRISPR-Cas9 plasmid 제작법으로 다수의 유전자 타깃 plasmid 제작 ○ Williams82콩과 대원콩의 CRISPR-Cas9-Agrobacterium-mediated transformation 시스템으로 제초제 저 |
