| 초록 |
□ 연구개요 Prx3의 발현이 억제된 심근세포주 (H9c2, rat cardiomyocyte)을 사용하여 Hypoxia/Reoxygenation 및 Doxorubicin이 유발하는 미토콘드리아 산화적 손상 매개성 심근세포독성과 mitophagy 억제 매개성 심근세포독성을 방어하는 Prx3의 기능을 규명함. 또한, 구축된 세포주에 미토콘드리아 특이적 항산화 시스템인 Prx3를 adenovirus를 사용하여 보충 시 H/R 및 Dox에 의한 손상이 억제되는 것을 통해 Prx3의 loss-of-function을 검증함. 추가적으로 Prx3가 knockout된 mouse를 사용하여 허혈/재관류가 유발하는 심장 기능 및 미토콘드리아 손상, 세포사멸 등을 통해 산화적 손상을 분석함. □ 연구 목표대비 연구결과 ◆ ROS 중 H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 특이적으로 측정하는 방법을 이용하여 미토콘드리아의 H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>를 측정했으며, 미토콘드리아 특이적으로 DNA, protein, lipid의 oxidation을 측정하는 방법을 통해 Hypoxia/Reoxygenation 및 Doxorubicin이 유발하는 산화적 손상을 분석함. ◆ 또한, 미토콘드리아 막 전위를 측정하는 여러 방법과 apoptosis 측정법, 미토콘드리아 매개 세포 사멸을 볼 수 있는 방법등을 통해 Hypoxia/Reoxygenation 및 Doxorubicin이 유발하는 산화적 손상 매개 심근독성을 분석함. ◆ GFP-LC3 virus, mcherry-GFP-LC3 virus, LC3 conversion, fusion (Mfn1, Mfn2, OPA1) 및 fission 단백질 (Drp1)의 변화 분석, Mitotracker CMX Red를 이용한 미토콘드리아 크기 측정, Mitophagy 매개 단백질 (Parkin, PINK1, BNIP3) 변화 분석 등의 다양한 미토콘드리아 역학의 변화 및 autophagy, autophagy flux, mitophagy 측정 실험방법등을 확보하였으며, 이러한 실험등을 통해 Hypoxia/Reoxygenation 및 Doxorubicin이 유발하는 mitophagy 억제 매개성 심근독성을 분석함. ◆ Prx3 adenovirus를 이용해 Prx3가 knockout된 심근세포주에 Prx3를 다시 발현시켜 미토콘드리아 특이적 항산화시스템을 보충해주었으며, 위의 미토콘드리아 산화적 손상 매개성과 mitophagy 억제 매개성 심근독성에서 Prx3의 loss-of-function의 결과를 재검증하였음. ◆ Prx3을 심근 특이적으로 knockoout된 mouse를 제작하여 사용하진 못했으나, Prx3가 knockout된 mouse에서 심장기능 손상과 미토콘드리아 및 세포사멸 등을 분석함으로써, Prx3의 심근손상에 방어적 기능을 규명을 in vivo에서도 확인함. □ 연구개발성과의 활용 계획 및 기대효과 (연구개발결과의 중요성) ◆ 심근 독성 및 심부전을 유발하는 산화적 스트레스의 주된 원인은 mtROS라는 연구 논문과 리뷰 논문들이 많이 있고, mtROS인 superoxide anion (O<sub>2</sub>∙<sup>-</sup>), H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>, hydroxyl radical (∙OH) 중에서 H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>는 생체 반감기가 가장 길어서 농도가 가장 높고, 극성이 없어서 미토콘드리아 막을 가장 쉽게 통과하여 세포질 또는 다른 세포내 소기관들에 산화적 손상을 유발하는 특성이 있는데도 심근 독성이 유발되었을 때, 다른 ROS들과 구분하여 특이적으로 H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> level (특히, 미토콘드리아의 H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> level)만을 분석한 보고들은 지금까지 없었음. 본 연구를 통하여 심근세포/조직에서 H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> (특히, 미토콘드리아의 H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>)만 특이적으로 detection할 수 있는 fluorescent probe를 이용한 측정법을 확립하고 활용함으로써 다른 연구 그룹들에서 mtROS에 의한 기전, 즉, ROS가 구분되지 않은 비특이적 기전으로 기술해왔었던 기전들에 대하여 “미토콘드리아 H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>에 특이적인 기전”이라고 명확하게 구분하여 제시할 수 있음. ◆ 미토콘드리아 특이적 macromolecule (DNA, protein, lipid) oxidation 측정 방법, 미토콘드리아 품질 관리 중 하나인 분열(fission)과 융합(fusion)을 포함한 미토콘드리아 dynamic 측정 실험법, autophagy flux 측정법 그리고 mitophagy 단백질 분석법 등 다양한 미토콘드리아의 손상을 확인할 수 있는 실험법들을 확보하였으며, 미토콘드리아 손상 매개 질환의 분석에 활용할 수 있음. ◆ 미토콘드리아 H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>가 특이적으로 매개하는 미토콘드리아 및 심근 손상에 의한 심부전을 제어할 수 있는 효율적인 치료제 개발 및 관련 기술 향상에 기여할 것으로 기대됨. (출처 : 연구결과 요약문 2p) |
